杨 波 ，唐 丹 ，赵兰兰，杜 锴，徐 翔，李德红，潘 超，李 蓉，龚海兵，胡荣强，林冰森，罗 波，黄 炎

（1.中国大熊猫保护研究中心，大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草原局重点实验室，邛崃山、岷山濒危野生动植物保护生物学国家长期科研基地，都江堰，611830；2.简阳市规划和自然资源局林业服务中心，简阳，641400；3.丹巴县农牧农村和科技局，丹巴，626300）

非损伤性取样（noninvasive sampling）被广泛应用于濒危野生动物内分泌研究，主要来源于粪便、尿液、唾液、毛发和含口腔脱落细胞的食物残渣等［1］，其中粪便样品更易获得，适用于动物类固醇激素监测。类固醇激素可以较好地衡量动物繁殖状态、应激水平和健康状况等［2-3］。大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）作为国家一级重点保护野生动物，其野生生存状态和圈养种群管理状况备受关注。考虑到大熊猫野生个体的难觅性和圈养种群的动物福利，为了更有效地监测大熊猫的生理状况和评估其身体健康水平，粪便类固醇激素监测成为首选方法。对大熊猫而言，粪便皮质醇（cortisol，CORT）激素可用于分析自然环境因子（噪音、光照和高温等）［4-6］、特殊事件（麻醉、运输和放归）［6-8］对其造成的短期干扰应激，也可以进行长期监测以分析生活环境改变对其造成的生理影响［9］或研究圈养环境下特殊行为发生的生理机制［10］。除此以外，粪便类固醇性激素可以对雌/雄性大熊猫发情状态进行动态监测，有效地评估其繁殖生理情况［11-12］，还可以用于性别鉴定［13］等。

粪便类固醇激素的测定可能受到粪样采集、保存、运输和处理的影响［2］。已有研究得出大熊猫粪便类固醇激素含量受到粪便激素不均匀分布［14］、新鲜程度［15］、贮存条件［15］和取样量［16］等因素影响。目前常用真空冷冻干燥法干燥粪便和乙醇提取法萃取类固醇激素［6，9，13-14，17］。有文献［14，17］提及冻干后的粪便在粉末化处理过程中需要充分研磨，但研磨程度并未说明。因此，本研究利用不同孔径筛网对冻干后的粪便进行筛取以量化粪便颗粒大小，并测定粪便类固醇以探究粪便颗粒大小与激素含量的相关性，以期为大熊猫粪便类固醇激素研究提供一定的方法借鉴，也为大熊猫非损伤性取样研究提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 研究材料

中国大熊猫保护研究中心10 只成年雌性大熊猫的粪便，粪便类型为竹叶便和竹节便。试验期间个体健康状况良好。

1.2 样品采集与处理

2020 年7 月某一周，09：00—12：00 采集大熊猫新鲜粪便，使用一次性PE 手套将粪便放入自封袋，标注供者名称、日期、时间和粪便类型等信息，1 h内带回实验室，-20 ℃冻存，共收集竹叶便21 份、竹节便28 份。样品收集完毕，利用真空冷冻干燥机（北京亚星仪科LGJ-100FG）干燥样品至恒重。分别混合竹叶便和竹节便，用手轻揉粪便（避免扎伤），取出大块竹叶和竹节。充分混合后，依次使用3.35 mm（6 目）、1.70 mm（10 目）、0.88 mm（18 目）、0.43 mm（35 目）、0.23 mm（65 目）和0.12 mm（120 目）孔径筛网筛取粪便粉末。具体操作：先使用3.35 mm 筛网筛选混合样，水平匀速筛选3次，用12 mm×75 mm 的玻璃试管取满筛下物（即粪便粉末），封口；再使用1.70 mm 筛网对剩余的筛下物进行筛选，再用试管取满筛下物；按照该方法依次完成剩余筛网的筛取操作。筛取后的粪便粉末置于-80 ℃保存。

1.3 激素提取与测定

操作方法和测定方法参考唐丹等［7］。利用90%乙醇萃取粪便中类固醇激素，每个粪样激素提取 3次，具体操作：将每管粪便粉末（约1.2 g）从上至下均分为3 个部分（上部、中部和下部），将每部分粪样混合均匀后再从中各取出0.1 g用于激素提取；提取液置于-20 ℃冻存，待检测；采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定提取液中类固醇激素，包括雌酮-3-葡糖苷酸（estrone-3-glucuronide，E1G）、孕 酮（progesterone，P4）和CORT。单克隆抗体E1G R583、P4 CL425 和CORT R4866 来源于美国加州大学戴维斯分校人口健康与生殖系临床内分泌学实验室，由Coralie Munro 研发［11-12］。每种激素重复测定3板次，每板次2个重复。

1.4 数据处理与分析

激素测定的批内变异系数≤6%，批间变异系数≤10%。试验选取3 个因子：第1 个因子为粪便类型，分为竹叶便和竹节便；第2 个因子为取样部位，分为取样试管的上部、中部和下部3 个区组水平；第3 个因子为筛网孔径，试验包含3.35、1.70、0.88、0.43、0.23、0.12 mm 6个孔径水平。将以上各因子进行组合，共36个试验单元，每个单元设3×2个重复。利用SPSS 22.0处理数据，使用三因素析因设计一元定量资料方差分析对各因素的主效应和交互作用进行分析，建模时粪便类型归入随机因子，取样部位和筛网孔径为固定因子。各因子存在显著效应时，再进行简单效应分析、相关性分析（Pearson）或配对t检验分析（one sample Kolmogorov-Smirnov test 检验均为正态分布）。计量结果用mean±SD表示，显著水平设置为α=0.05。

2 结果

2.1 筛网孔径对激素的影响

三因素析因设计方差分析显示，无论在竹叶便还是竹节便中，取样部位与筛网孔径在3 个指标（E1G、P4 和CORT 含量）下均不存在交互作用（P=0.585、0.997、0.121、0.881、0.877 和0.668），筛网孔径在3 个指标下均存在主效应。以筛网孔径为比较的简单效应分析显示，竹叶便中的E1G、P4 和CORT 含量在不同筛网孔径间的差异性存在不同表现（图1A1-A3），E1G 和CORT 含量在不同孔径间的差异不存在统计学意义（P=0.052、0.652），而P4 含量有显著差异（P＜0.001），并且激素含量与孔径存在显著负相关性（r=-0.617，P＜0.001）。进一步分析显示，竹叶便P4 含量在3.35 mm 与1.70 mm 孔径下最低，且均与0.88 mm存在显著差异性（P＜0.05），与0.43、0.23、0.12 mm 间存在 极显著 差异性（P＜0.001），并且0.88 mm 与0.43、0.23、0.12 mm 间也存在显著差异性（P≤0.015），其余组间的差异无统计学意义。根据各组间的差异特性，可将3.35、1.70 mm 视为一个整体水平，为（463.8±75.6）ng/g；0.88 mm 为一个水平，为（634.4±174.0）ng/g；0.43、0.23、0.12 mm为一个整体水平，为（863.5±208.8）ng/g。

图1 粪便颗粒径对大熊猫粪便激素含量的影响Fig.1 Effect of fecal partide size on fecal steroids content of giant panda

竹节便中E1G、P4 和CORT 含量与筛网孔径均存在显著负相关性（r=-0.804、-0.786、-0.643，P＜0.001）（图1B1-B3），激素含量大致呈现随筛网孔径增加而减少的趋势。E1G、P4含量在各组间（不同孔径）的差异性特征与竹叶便P4 相似，也可将3.35、1.70 mm 视为一个整体水平，0.88 mm 为一个水平，0.43、0.23、0.12 mm 为一个整体水平。而CORT 含量的差异表现有所不同，具体表现为3.35、1.70、0.88 mm 间的差异不显著（P≥0.139），0.43、0.23、0.12 mm间也不显著（P≥0.392），0.88 mm与0.43 mm同样不存在显著差异性（P=0.107）；其余组间的差异显著（P≤0.039）。因此，可将3.35、1.70、0.88 mm视为一个整体水平，为（203.6±35.4）ng/g；0.43、0.23、0.12 mm为一个整体水平，为（274.1±38.1）ng/g。或将3.35、1.70 mm，0.88、0.43 mm，0.23、0.12 mm视 为3 个不同 的水平，分别为（194.8±34.5）、（241.5±39.2）、（280.3±37.7）ng/g。

2.2 取样部位对激素的影响

不同取样部位在3 个指标（E1G、P4 和CORT）上均表现出极显著差异性（P＜0.001）。进一步对各组间差异性进行配对t检验显示：竹叶便E1G 与P4，上部与中部均不存在显著差异（t=-1.915、-0.506，P=0.114、0.634），其余各组间均存在显著差异性（t≤-2.642，P≤0.046）（图2A1-A2）；而CORT 在各组间的差异均显著（t≤-3.957，P≤0.011，图2A3）。竹节便E1G 与P4 只在中部与下部间存在不显著差异（t=-1.970、-0.994，P=0.106、0.366），其余各组间的差异均显著（t≤-3.622，P≤0.015）（图2B1-B2）；CORT在各组间的差异性均显著（t≤-8.230，P＜0.001，图2B3）。

图2 取样管中不同部位的粪便激素含量Fig.2 The difference of fecal steroids content in the top，middle and bottom of sampling pipe

3 讨论

大熊猫主食竹类，食物残渣通过肠道会混合大量的消化液和类固醇激素等代谢产物。由于大熊猫不能消化竹纤维，不同程度大小的竹纤维（竹叶或竹节）是否会影响激素含量测定需要进行验证。因此，本研究利用筛网剔除不同尺寸的竹叶或竹节，量化粪便颗粒大小以探究其与激素含量的相关性，进而探讨竹纤维的影响程度以降低粪便处理可能造成的试验误差，提高检测准确性。结果显示，3.35、1.70 mm孔径筛下物的激素含量表现出最低的水平，0.88 mm次之，0.43、0.23、0.12 mm 的激素水平表现最高。除竹叶便E1G 和CORT 不符合这种规律外（不同粒径间激素含量均不存在显著差异），其余均符合。在一定程度上可以证实，孔径越小的筛网筛选的粪便颗粒中含有的激素越多。这种现象可能是越小的粪便颗粒其表面积越大，会吸附更多的类固醇激素；粪便类固醇激素主要来源于肠组织，粪便表层会直接接触肠黏膜而积累更多的激素［14］，这类黏膜物质被冻干后会变成较小的颗粒物。另外，激素含量是指单位干重粪便中的激素质量，在同等取样量下，粪便颗粒越小且占比越大时，其激素含量也会越高。有研究表明，动物所食食物纤维含量与粪便激素含量存在着关联性［18］，对于食物纤维含量较高的动物粪便采用冻干研筛的处理方式得到的激素含量要比冻干研磨的高，而这种差异性归因于高纤维食物的影响［19］。因此，筛网孔径的选择应考虑到动物的食物结构即高纤维含量和消化特点，如李静宇［19］会利用0.03 mm 孔径的筛网处理短尾猴（Macaca thibetana）粪便以检测雌二醇与孕酮含量。对大熊猫而言，其粪便中含有较高的竹纤维，竹纤维几乎占据整团粪便且尺寸较大。大孔径的筛网会筛选出更多的竹纤维，而小孔径的筛网会增加筛取难度和减少粪样获取量以至于分析样品量不足。研究结果表明0.43、0.23、0.12 mm 孔径间均不存在显著差异，但从实操性考虑，0.43 mm（35 目）孔径筛网是较为合适的选择。

除此以外，本研究还发现类固醇激素含量与样品在取样试管中的位置存在一定的相关性。取样试管上、中、下各组间在E1G、P4 和CORT 上均表现出极显著差异水平，虽然各激素差异性表现有所不同，但仍可以发现，上部与下部间的激素含量在3 个指标下均存在显著差异（图2），下部的激素含量最高。究其原因，可能是为了取满粪样，操作时会提供向下的作用力，同时受到“巴西坚果效应”（Brazil-nut effect）［20］的影响，使得体积较大的粪便颗粒上升到表层，而较小的粪便颗粒沉降到底部。从上往下的取样方式使越靠近底部的小颗粒粪便含量增加，激素含量也随之增高。因此为了减轻这种影响，前人研究中均提到样品均质化的必要性［2，14］，本研究进一步进行了相关验证。因此，笔者建议取样时不宜将取样管装得过满，约占取样管一半为宜，留足空间便于采用上下颠倒的方式进行混样。

综上，筛网孔径的正确选择和粪样的充分混合是必要和重要的，会大大提高激素测定的准确性。本研究不仅提供了一种适用于大熊猫粪便类固醇监测的真空冷冻干燥研筛法（简称为冻干研筛法），还提供了一种可作参考的混样方法，以期为大熊猫粪便类固醇激素研究提供方法借鉴，为今后粪便激素监测方法的标准化建立提供一定的基础性参考。

致谢：本研究得到了中国大熊猫保护研究中心严啸博士在数据处理与分析上的帮助，以及神树坪基地张贵权主任和李果、程建斌等同事在样品采集上的大力支持与协助，在此一并表示由衷的感谢。