任锡跃，刘 涛 ，朱发亮，王志江，叶贤文，梅 坚 ，王建军

1. 云南农业大学农学与生物技术学院，昆明市盘龙区沣源路452 号 650201

2. 云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，昆明市茨坝镇青松路21 号 650201

3. 云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室，昆明市茨坝镇青松路21 号 650201

4. 云南省烟草公司昆明市公司，昆明市盘龙区北京路523 号 650051

寄生疫霉（Phytophthora parasitica）属卵菌纲（Oomycetes）、霜 霉 目（Peronosporales）、腐霉科（Eythictceae）、疫霉属（Phytophthora），是一种寄主范围较广泛的病原菌，可侵染烟草、茄子和番茄等植物［1］。其中，P. parasitica 侵染烟草可引起烟草黑胫病，染病烟株茎基部产生黑斑，叶片自下而上变黄，最后全株枯萎，对我国的烟叶生产造成巨大的损失。目前常使用甲霜灵、烯酰吗啉等农药防治烟草黑胫病，但大量使用农药会出现药品残留、病原菌产生抗药性和环境污染等问题，不利于烟草行业的可持续发展［2-3］。

植物诱抗剂又名激发子，是一类可诱导寄主植物产生防卫反应的特殊化合物的总称。相比农药，植物诱抗剂具有安全、高效和抗性稳定等优点，可为烟草黑胫病防治提供新思路。β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）是从经暴晒番茄根系中分离得到的一种次生代谢非蛋白氨基酸［4］，作为一种高效的植物诱抗剂，能够增强植物对多种病害的抵抗能力。Wang 等［5］研究发现，BABA 处理可诱导PR 表达量显著增加，有助于葡萄抵御灰霉病菌（Botrytis cinerea）的侵染；Yao 等［6］研究表明，BABA有利于异黄酮生物合成和胼胝质沉积，从而增强大豆对蚜虫的抗性；何小龙等［7］报道，5.0 mmol/L BABA 可提高烟草对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的抑制率，降低田间烟草花叶病的发病率和病情指数。然而，目前关于BABA 诱导烟草对P. parasitica 引起的烟草黑胫病抗性的研究还鲜见报道。为此，以云烟87为试验材料，对供试烟草分别进行BABA 和蒸馏水喷施处理，并用P.parasitica 侵染处理后的烟草，调查BABA 对烟草黑胫病的防治效果，测定并分析BABA 处理前后烟叶的防御酶活性、活性氧和MDA含量以及抗性相关基因的表达量变化，以期为BABA 在烟草病害防治中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

供试烟草品种为云烟87。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟草长至成苗期时移栽至装有灭菌营养土的塑料钵中，待烟草长到5～6 叶期时用于试验处理。供试菌种为P. parasitica，由西南生物多样性实验室分离并保存。BABA购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 BABA对烟草黑胫病的防治效果测定

试验共设置2个处理（处理A：喷施3次蒸馏水，每次间隔3 d，最后一次喷施3 d 后用菌丝块创伤茎基部接种法［8］接种 P. parasitica；处理 B：喷施 3 次5 mmol/L BABA，每次间隔3 d，最后一次喷施3 d后接种P. parasitica），每个处理共计烟株10 株。处理后，以株为单位对烟草黑胫病的严重度进行分级（0～9级）调查。其中全株无病的烟株记为0级；茎部病斑不超过茎围的1/2，或1/3以下叶片凋萎的烟株记为1级；茎部病斑环绕茎围 1/3～1/2，或1/3～1/2 叶片轻度凋萎，又或下部少数叶片出现病斑的烟株记为3级；茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2～2/3 叶片凋萎的烟株记为5 级；茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎的烟株记为7级；病株基本枯死的烟株记为 9 级。依据 GB/T 23222—2008［9］统计发病率、病情指数和防治效果，计算公式：

1.2.2 烟叶生理生化指标和抗性相关基因表达量测定

试验共设置4 个处理（处理1：喷施蒸馏水，不接种P. parasitica；处理2：喷施5 mmol/L BABA，不接种 P. parasitica；处理 3：喷施蒸馏水，3 d 后接种P. parasitica；处理4：喷施5 mmol/L BABA，3 d 后接种P. parasitica），每个处理共计烟株20 株，处理4 d后，取各处理的中部烟叶保存，后续用于烟叶生理生化指标和相关基因表达量的测定。

1.3 试验方法

1.3.1 防御酶活性测定

过氧化物酶（Peroxidase，POD）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）为防御酶，这类酶不仅能清除植物受病原物侵染后形成的活性氧，而且能催化生成许多与抗性相关的化合物，在植物抗病反应中有重要作用［10］。使用苏州格锐思生物科技有限公司的酶活性检测试剂盒检测上述3种酶活性，试验方法为分光光度法［11］，试验仪器为紫外-可见分光光度计（UV-2450，日本岛津公司），依据试剂盒说明书中的计算方法计算POD、PPO和CAT活性。

1.3.2 超氧阴离子（O2-）和丙二醛（MDA）的含量测定

超氧阴离子自由基的含量可间接反映组织细胞受损状况和抗性强弱；MDA的含量多少与膜脂过氧化程度、膜结构的受伤程度和植物的自我修复能力密切相关［12］。使用苏州格锐思生物科技有限公司O2-和MDA 检测试剂盒检测 O2-和MDA 的含量（质量分数），试验方法为分光光度法［11］，试验仪器为紫外-可见分光光度计（UV-2450，日本岛津公司），依据试剂盒说明书中的计算方法计算O2-和MDA含量。

1.3.3 抗性相关基因表达量测定

用TRIzol 法提取烟草总RNA，并进行纯化。总RNA 用于反转录合成第一条链cDNA。将cDNA 作为模板，进行qPCR反应。反应体系为：cDNA 1 μL、SYBR Green超混合液10 μL、上游引物和下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。用于qPCR的引物信息见表1。以Actin为内参基因，参照公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量［12］。

表1 实时定量PCR分析的基因和引物Tab.1 Genes and primers for real time quantitative PCR analysis

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计分析，使用最小显著差数法进行数据间差异的显著性检验，使用GraphPad Prism软件制图。

2 结果与分析

2.1 BABA对烟草黑胫病的抗性诱导效果

研究发现两个处理的烟草黑胫病发病率都为100.0%。处理A 的烟草病情指数为35.6，处理B 的烟草病情指数为15.6。5 mmol/L BABA对烟草黑胫病的防治效果为56.3%（表2）。

表2 不同处理对烟草黑胫病的防治效果Tab.2 Control effects of different treatments against tobacco black shank disease

2.2 BABA诱导烟叶产生枯斑与HIN1表达量

BABA处理烟草3 d后烟叶渐黄，形成坏死型枯斑，且下部烟叶枯斑的量和面积较上部烟叶大而多（图1A），该病症与超敏反应（Hypersensitive response，HR）的症状类似。HIN1（Harpin-induced gene 1）为Spm（精氨）的蛋白诱导基因，而Spm 可作为信号参与超敏反应途径［13］，测定该基因的循环阈值（Cycle threshold，CT）并计算其表达量，发现处理2的HIN1 基因表达量显著高于处理1，处理4 的HIN1基因表达量显著高于处理3（图1B）。

图1 BABA喷施后烟叶的超敏反应Fig.1 Hypersensitive response of tobacco leaves after spraying BABA

2.3 BABA对烟草叶片防御酶的影响

由图 2 可见，处理 2 的 POD、PPO 和 CAT 活性分别比处理1显著提高了129.6%、81.3%和32.4%；处理4的POD和PPO分别比处理3显著提高了264.4%和169.0%。表明在烟草感染黑胫病的过程中，BABA可诱导烟草叶片中PPO、POD和CAT活性提高。

图2 不同处理对烟草防御酶的影响Fig.2 Effects of different treatments on tobacco defense enzymes

2.4 BABA 对烟草 O2-、MDA 含量以及抗性相关基因表达量的影响

处理2 的O2-含量比处理1 显著增加142.2%；处理4的O2-含量比处理3显著增加31.8%，但处理4与处理2相比，O2-含量显著降低（图3A）。此外，处理2的MDA 含量比处理1 显著增加311.0%，处理3 和处理4 的MDA 含量均比处理2 显著降低，且处理3 和处理4的MDA含量无显著差异（图3B）。NtrbohD基因可编码NADPH氧化酶［又名呼吸爆发氧化酶同源蛋白（Respiratory burst oxidase homolog ，RBOH）］，而NADPH氧化酶又可促进活性氧的产生［14］，故测定该基因的表达水平，发现处理1 和处理2 的NtrbohD基因相对表达量无显著差异；处理4 的NtrbohD基因相对表达量比处理3显著降低56.9%（图3C）。

图3 不同处理对烟草活性氧及相关基因的影响Fig.3 Effects of different treatments on reactive oxygen and related genes in tobacco

3 讨论

5 mmol/L BABA 喷施烟草3 d 后烟叶产生较多枯斑，根据Siegrist等［15］的研究，BABA诱导叶面枯斑的产生是一种超敏反应，该反应可阻止P. parasitica的扩散，减弱黑胫病对植株的危害。本研究中发现 BABA 诱导 PPO、POD 和 CAT 活性提高，这与前人［16-20］的研究结果一致。其中，PPO 和 CAT 活性的提高，可维持烟草对氧自由基的清除能力，保持植物体内氧自由基的平衡。此外，PPO 和POD 活性的提高可使烟草中酚类物质和芳香胺氧化为植保素和木质素，抵御P. parasitica侵染［21-22］。

本研究中发现BABA 可诱导烟叶活性氧O2-含量显著升高，活性氧能直接杀死病原菌并激活抗病基因的表达，其迸发是植物产生的最快的防御反应，在植物免疫过程中起着至关重要的作用，可增强烟草对黑胫病的抗性［23］。本研究中还发现处理1和处理2 NtrbohD 的表达量无显著差异；处理4 NtrbohD的表达量比处理 3 显著降低，这与 Peng 等［24］发现化学诱抗剂氟噻唑吡乙酮（Oxathiapiprolin）在增加拟南芥活性氧的同时还上调了RBOHD 表达水平的研究结果不一致，推测原因是BABA 诱导CAT 和POD酶活性提高从而抑制了接种P. parasitica 后活性氧的迸发，使该基因的表达水平达到动态平衡，在激活防御体系的同时缓解了活性氧对植物的氧化损伤。

4 结论

使用5 mmol/L BABA 处理烟草，发现BABA 可诱导烟草产生超敏反应，并提高HIN1 基因的表达量。此外，烟草未接种P. parasitica时，BABA处理可诱导烟叶O2-含量增加142.2%，说明BABA可促使活性氧迸发。烟草接种P. parasitica 后，BABA 处理可诱导烟叶POD 和PPO 活性分别提高264.4%和169.0%，但该处理的NtrbohD 基因表达量降低了56.9%。BABA 处理可维持烟草对由P. parasitica 伤害产生的氧自由基的清除能力，抑制活性氧迸发，缓解活性氧对烟草的伤害，对烟草黑胫病的防治效果达到56.3%。