田绍锐，温玉霞，马 婷，陈海涛，徐 宸，汪代斌，孙现超*

1. 西南大学植物保护学院，重庆市北碚区天生路2 号 400715

2. 重庆烟草科学研究所，重庆市北碚区天生路216 号 400715

烟草病毒病是烟草生产上的重要病害之一［1］，一旦发生流行会造成严重的经济损失［2］。因此，对烟草病毒病的有效防治已成为烟草生产上急需解决的问题［3］。据报道，烟草上已分离到的病毒种类有47种，我国烟草上已鉴定出的病毒有17种［4-5］，重庆烟区烟草上已鉴定出的病毒有9 种，包括烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黄 瓜 花 叶 病 毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）、烟草番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）和马铃薯 X 病毒（Potato virus X，PVX）等［6-9］。辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）为（+）ssRNA 病毒，属于马铃薯Y 病毒科马铃薯Y 病毒属（Potyvirus），主要为蚜虫以非持久性方式进行自然传播，传播扩散速度快，该病毒在全球多个国家和地区广泛发生，严重危害辣椒和烟草［10］。2000 年报道该病毒侵染烟草［11］，2015年首次报道在重庆辣椒上检测出ChiVMV［12］。该病毒具有较强的致病性和破坏性，侵染烟草后会诱发系统性叶片枯斑，感病部位细胞坏死。随着病毒的扩散症状越发严重，烟草叶片自下而上干枯脱落甚至整株死亡［13］。随着交通和物流业的快速发展，病毒的远距离传播率增加。ChiVMV这个局部区域发生的病毒也开始在新的烟区出现。近两年来，在重庆烟区发现了叶片出现黄化斑点、枯斑等症状的烟株，疑似报道的ChiVMV感染症状。为了明确发病植株中是否含有ChiVMV，以及是否为复合侵染，采用分子生物学检测方法对重庆烟区出现疑似ChiVMV侵染症状的烟叶样品进行病毒种类检测鉴定，并确定当前烟草病毒的种类、发生及复合侵染情况，旨在有针对性地制定综合防治措施，进而有效控制病毒病。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

于2019—2020 年在重庆涪陵（11 份）和巫溪（6份）两个烟区采集发病烟草样品17份，在重庆北碚区西南大学烟草试验田采集发病烟草样品1份，烟叶表现出不同程度的花叶、黄化、皱缩、枯斑等症状。病原鉴定在西南大学植物保护学院植物免疫与病害生态防控实验室完成。

RNA 提取试剂 RNAiso Plus（Code No. 9109）、rTaqTMPolymerase［宝日医生物技术（Takara）有限公司］；反转录试剂盒NovoScrip Plus All-in-onev1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（E047，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司）；大肠杆菌Escherichia coli DH5α、T 载体（北京全式金生物技术有限公司）；DNA 回收试剂盒Universal DNA Purification Kit（北京擎科生物科技有限公司）；所用引物均由深圳华大基因股份有限公司合成；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇等均为分析纯（重庆市钛新化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录

采用RNAiso Plus 进行烟叶总RNA 提取，方法详见 https：//www.takarabiomed.com.cn/DownLoad/91 08-9109.pdf。使用近岸蛋白NovoScrip Plus All-inonev1st Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录，参考说明书（https：//www.novoprotein.com.cn/Public/Uploads/uploadfile/files/Molecule_DS/E047.pdf）进行操作。反转录体系：2×NovoScript Plus 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix 10 μL，RNA（100 ng）模板2 μL，gDNA Purge 1 μL，加入DEPC 处理水至20 μL。反转录程序：50 ℃反应20 min，75 ℃终止反应5 min，16 ℃保存5 min。

1.2.2 病毒外壳蛋白扩增、克隆及测序

根据NCBI 已报道上述病毒的外壳蛋白序列并参考本实验室的前期研究［14］，使用下列引物进行试验（表1）。PCR 扩增体系为：2×PCR Mix 10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各1 μL，模板DNA（100 ng）1 μL，加ddH2O补足至20 μL。PCR扩增程序按照近岸蛋白2×Taq Master Mix（https：//www.novoprotein.com.cn/Public/Uploads/uploadfile/files/Molecule_DS/E005.pdf）说明书设置。

表1 RT-PCR扩增的特异性引物Tab.1 Specific primers used for RT-PCR

参考DNA回收试剂盒（北京擎科生物科技有限公司）操作说明（https：//tsingke-oss.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/prod/3d3703039c984637a97d8e033eb48 4c9.pdf）将目的条带回收，并将回收的片段与pGEM-T Easy 载体连接后进行大肠杆菌转化，于37 ℃条件下培养16 h 后挑选数个阳性克隆送至深圳华大基因股份有限公司进行测序。

1.2.3 进化关系分析

使用 BLAST（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）进行序列比对，选择同源性较近或GenBank数据库中已公布的病毒，用MEGA 7.0 软件中的Clustal-W 程序进行比对分析，然后采用邻近法（Neighbor-joining，NJ）构建进化树，使用1 000 次自导复制验证可信度［15-16］。使用DNAMAN软件进行序列同源性比对分析［17］。

2 结果与分析

2.1 感病烟叶的症状分析

采集重庆涪陵（11 份）和巫溪（6 份）两个烟区与北碚试验田（1份）共18份发病烟叶样品。样品均表现出不同程度的花叶、黄化、皱缩和枯斑等症状。其中涪陵地区烟叶枯斑较多，巫溪地区发病烟叶有较多闪电斑点，北碚地区发病烟叶有较多黄色斑点状病斑（图1）。根据烟叶发病症状，推测巫溪地区烟叶样品中可能含有PVY，且样品中可能存在多种病毒复合侵染的情况。

图1 病毒侵染烟叶样品的症状表现Fig.1 Symptoms of tobacco samples infected by viruses

2.2 感病烟叶的RT-PCR分析

利用包括TMV CP、CMV CP、PVX CP、TSWV CP 和ChiVMV CP 在内的多个病毒特异性引物，对重庆涪陵、巫溪2个烟区及北碚烟草试验田发病烟叶样品的总RNA进行RT-PCR扩增，并检测涪陵、巫溪2个烟区及北碚烟草试验田发病烟叶的病毒种类，结果见表2。涪陵烟区烟叶扩增出TMV CP 和ChiVMV CP，没有扩增出 CMV CP、PVY CP 和TSWV CP。巫溪烟区烟叶中扩增出TMV CP 和PVY CP，没 有 扩 增 到 CMV CP、TSWV CP 和ChiVMV CP，见图2。北碚烟草试验田发病烟叶中扩增出ChiVMV CP，未检出其他病毒。在18份样品中，检测到ChiVMV、TMV、PVY 3种病毒，总检出率分别为66.67%、66.67%和22.22%。涪陵烟区烟叶样品中检测出ChiVMV和TMV，检出率分别为100%和54.55%；巫溪烟区烟叶样品中检测出TMV 和PVY，检出率分别为100%和66.67%；北碚烟草试验田病叶样品中检测出ChiVMV，检出率为100%。因此，重庆巫溪地区烟叶主要受TMV和PVY侵染，而涪陵地区烟叶主要受TMV和ChiVMV侵染。此次两个烟区烟叶样品中病毒检测结果有所不同。涪陵烟区的11份烟叶样品中均检测出ChiVMV，其中有6份烟叶样品中还检测出TMV，形成“ChiVMV+ TMV”的复合侵染类型，复合侵染率为54.55%。ChiVMV的检出率明显高于TMV，可以推测在涪陵烟区ChiVMV 的侵染力强于TMV。巫溪烟区的6份烟叶样品中均检测出TMV，其中有4 份烟叶样品中还检测出PVY，形成“TMV+PVY”的复合侵染类型，复合侵染率为66.67%（表2）。可见TMV 的检出率明显高于PVY 的检出率，推测在涪陵烟区TMV的侵染力强于PVY。

图2 5种病毒CP RT-PCR扩增的电泳图Fig.2 Electrophoretogram for detection of CP of 5 viruses amplified by RT-PCR

表2 烟草样品的病毒侵染类型和检出率Tab.2 Types and detection rates of viruses in tobacco samples

2.3 ChiVMV进化关系分析

将获得的ChiVMV CP 分离物上传至NCBI，利用Blast 对其CP 序列进行序列分析，将比对出的GenBank 中 12 个 ChiVMV CP 分离物构建系统进化树。进化分析结果（图3）显示，ChiVMV CP 重庆烟草分离物与其中4分离物形成1个分支，其他8个分离物共同形成另1个分支。重庆涪陵烟草分离物与中国泸州烟草（GenBank 登录号MK405594）亲缘关系最近，同源性为99.11%（表3）。将上述分离物进行序列比对分析，发现各CP分离物的N端变异程度较低，C端变异程度高于N端（图4）。

图4 ChiVMV CP分离物的基因序列比对Fig.4 Gene sequence alignment of ChiVMV CP isolates

表3 基于ChiVMVCP分离物的基因序列相似性比较Tab.3 Sequence similarity of CP gene based on ChiVMV isolates

图3 基于ChiVMV CP分离物的基因序列进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on ChiVMV CP isolates

3 结论

①从重庆涪陵烟区烟叶样品中检测出ChiVMV和TMV，检出率分别为100%和54.55%；重庆巫溪烟区烟叶样品中检测出TMV 和PVY，检出率分别为100%和66.67%；重庆北碚烟草试验田病叶样品中检测出ChiVMV，检出率为100%。②在重庆涪陵、北碚地区烟叶样品中首次检测出ChiVMV。③重庆涪陵烟区烟叶样品中检测出的ChiVMV 的CP 序列与四川泸州烟叶ChiVMV CP分离物亲缘关系最近。