孙 婷，王 震，黄素霞，崔明珠，杨 扬

1)驻马店市中心医院麻醉科 河南驻马店 463000 2)河南省人民医院麻醉与围术期医学科 郑州 450003

肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率与病死率逐年上升，手术、放疗等是临床治疗的主要方式，但其发病隐匿、复发率高且不良反应较多[1]。研究[2-3]表明酰胺类局部麻醉药物对肿瘤细胞生长及转移具有重要影响。布比卡因属于酰胺类局部麻醉药物，研究[4]表明布比卡因可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭。miR-143-3p可通过靶向调控FGF1表达而抑制肝癌细胞增殖及侵袭[5]。研究[6]表明miR-143-3p可通过靶向调控FZD4从而参与结直肠癌发生及发展过程。本研究旨在分析布比卡因是否可通过调控miR-143-3p而调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂布比卡因购自北京百奥莱博科技有限公司；人肝癌细胞Hep3B购自上海弘顺生物科技有限公司；反转录、荧光定量PCR试剂购自北京天根生化科技有限公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂购自美国Thermo Fisher公司；miR-阴性对照(NC)、miR-143-3p mimic、抗miR-NC、抗miR-143-3p购自广州锐博生物公司；MTT试剂、Transwell小室、Matrigel基质胶购自北京索莱宝公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 实验分组①Hep3B细胞接种于6孔板，加入100、200、400 μmol/L布比卡因培养24 h[7]，同时将正常培养的Hep3B细胞作为空白对照组。②将miR-NC、miR-143-3p mimic转染Hep3B细胞，分别记为miR-NC组、miR-143-3p组。③将抗miR-NC、抗miR-143-3p转染Hep3B细胞，加入400 μmol/L布比卡因培养24 h，分别记为抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因组、抗miR-143-3p+400 μmol/L布比卡因组。各组3个复孔，实验重复3次。

1.3 细胞增殖能力的MTT法检测各组Hep3B细胞接种于96孔板，加20 μL MTT溶液，培养4 h弃上清，加150 μL DMSO，应用酶标仪于490 nm处检测吸光度(A)值。

1.4 细胞周期的检测取各组Hep3B细胞(2×105个/mL)，10 000 r/min离心5 min，用预冷PBS洗涤，加入500 μL预冷PBS重悬细胞，加入预冷体积分数70%乙醇，4 ℃冰箱内孵育24 h，加入50 μL RNaseA，于37 ℃水浴30 min，加入450 μL PI染色液染色30 min，应用Calibur流式细胞仪检测细胞周期。

1.5 细胞迁移与侵袭能力的检测迁移实验：各组Hep3B细胞接种于Transwell上室，下室加600 μL含血清的培养液，培养24 h后多聚甲醛固定细胞20 min，结晶紫染色15 min，显微镜下统计各组迁移细胞数。侵袭实验：Matrigel基质胶稀释液加入上室(50 μL/孔)，后续实验步骤同迁移实验。

1.6 miR-143-3p的 qRT-PCR检测用Trizol试剂提取各组Hep3B细胞总RNA。反转录体系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，ddH2O补足体系至20 μL。反应条件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。反转录得到cDNA。以cDNA为模板进行PCR，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O补足体系至25 μL；反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃变性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循环。miR-143-3p上游引物5’-GGGCGCCGACATTCAA-3’，下游引物5’-ACTGCAGTGTCTTCTCCCTTCAA-3’； 内参U6上游引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。采用2-ΔΔCt法计算miR-143-3p相对表达量。

1.7 CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的Western blot检测各组Hep3B细胞加裂解液提取细胞总蛋白，BCA测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离，转膜、封闭2 h，加CyclinD1、MMP-2、MMP-9一抗(均1∶800稀释)与内参β-actin抗体(1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜，加二抗(1∶3 000稀释)室温孵育1 h，滴加ECL，暗室内曝光显影，用Image J软件检测各条带灰度值，结果取目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值。

1.8 统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。miR-NC组、miR-143-3p组，抗miR-NC+400 μmol/L 布比卡因组、抗miR-143-3p+400 μmol/L 布比卡因组间各指标的比较采用两独立样本t检验；不同浓度布比卡因组细胞周期，增殖、迁移、侵袭能力及其相关蛋白和miR-143-3p相对表达量的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同浓度布比卡因组Hep3B细胞增殖能力、细胞周期的比较与空白对照组比较，100 μmol/L布比卡因组、200 μmol/L布比卡因组、400 μmol/L布比卡因组细胞A值和CyclinD1蛋白表达水平逐渐降低，G1期细胞比例逐渐升高，S期细胞比例逐渐降低，见图1、表1。

1：空白对照组；2：100 μmol/L 布比卡因组；3：200 μmol/L 布比卡因组；4：400 μmol/L 布比卡因组

2.2 不同浓度布比卡因组Hep3B细胞迁移、侵袭能力及miR-143-3p表达的比较与空白对照组比较，100 μmol/L布比卡因组、200 μmol/L布比卡因组、400 μmol/L布比卡因组Hep3B细胞迁移细胞数、侵袭细胞数及其相关蛋白表达水平逐渐降低，miR-143-3p相对表达量逐渐升高，见图2、表2。

1：空白对照组；2：100 μmol/L 布比卡因组；3：200 μmol/L 布比卡因组；4：400 μmol/L 布比卡因组

表1 不同浓度布比卡因组Hep3B细胞增殖能力、细胞周期的比较(n=3)

表2 不同浓度布比卡因组Hep3B细胞迁移、侵袭能力及miR-143-3p表达水平的比较(n=3)

2.3 miR-NC和miR-143-3p组Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力的比较与miR-NC组比较，miR-143-3p组miR-143-3p表达水平、G1期细胞比例升高，细胞A值、迁移细胞数、侵袭细胞数及其相关蛋白表达水平降低，S期细胞比例降低，见图3、表3。

2.4 抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因组与抗miR-143-3p+400 μmol/L布比卡因组Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力的比较与抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因组比较，抗miR-143-3p+400 μmol/L布比卡因组miR-143-3p表达水平、G1期细胞比例降低，细胞A值、迁移细胞数、侵袭细胞数及其相关蛋白表达水平升高，S期细胞比例升高，见图4、表4。

1：miR-NC组；2：miR-143-3p组

1：抗miR-NC+400 μmol/L 布比卡因组；2：抗miR-143-3p+400 μmol/L 布比卡因组

表3 miR-NC组和miR-143-3p组Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力的比较(n=3)

表4 抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因组与抗miR-143-3p+ 400 μmol/L布比卡因组Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力的比较(n=3)

3 讨论

布比卡因可促进结肠癌细胞凋亡，并可抑制裸鼠移植瘤生长[8];可抑制膀胱癌细胞增殖及促进细胞凋亡[9]；可通过调节circ_0000376/miR-145-5p轴而抑制胃癌细胞增殖及转移[10]。本研究结果显示，布比卡因处理后肝癌细胞Hep3B增殖能力降低，G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低，提示布比卡因可抑制肝癌细胞增殖及诱导细胞周期阻滞。CyclinD1可正向调控细胞周期从而促进细胞周期进程[11]。本研究结果显示，布比卡因可降低CyclinD1蛋白表达水平，进一步证实布比卡因能够减弱肝癌细胞增殖能力。MMP-2、MMP-9可降解细胞外基质而促进细胞转移[12]。本研究结果显示，布比卡因可降低肝癌细胞Hep3B迁移及侵袭能力，并可抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达，提示布比卡因可抑制肝癌细胞迁移及侵袭。

在胆囊癌[13]、肺癌[14]组织中miR-143-3p表达下调，上调miR-143-3p表达可抑制癌细胞迁移及侵袭。本研究结果显示，布比卡因可增高肝癌细胞miR-143-3p的表达水平，从而抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及诱导细胞周期阻滞，抑制miR-143-3p表达可拮抗布比卡因对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及细胞周期的影响。以上结果提示布比卡因可通过促进miR-143-3p表达从而发挥抗肝癌作用。

综上所述，布比卡因可抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭，诱导细胞周期阻滞，miR-143-3p可能作为布比卡因抗肝癌的潜在靶点。但关于其具体作用机制仍需进一步探究。