周 洋，杨嘉君

1)上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306 2)上海市第六人民医院神经内科 上海 201306

胶质瘤约占原发性颅内肿瘤的60%，迄今为止，其具体的分子机制尚不明晰[1-2]。丁酸钠(sodium butyrate,NaB)是一种短链脂肪酸盐，在人体内主要来源于大肠微生物对不可消化多糖的厌氧发酵[3]。NaB可以通过改变胶质瘤细胞线粒体通透性转换孔的开合影响细胞凋亡[4]。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是一种DNA烷基化试剂，可透过血脑屏障诱导胶质瘤细胞DNA甲基化，并导致细胞凋亡[5]，是胶质瘤治疗的一线药物，但患者也很容易对TMZ产生耐药[6]。细胞焦亡也是一种程序性细胞死亡过程[7]。与凋亡不同，焦亡是通过效应蛋白Caspase-1实现的[8]，这一蛋白的活化会刺激消皮素D(gasdermin D，GSDMD)的活化、裂解，其N末端在细胞表面形成穿孔，造成细胞破裂，进而导致众多促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的激活，进一步促发强烈的炎症反应[9]。细胞凋亡则难以产生这种强烈的炎症反应。本研究聚焦于NaB联合TMZ对胶质瘤细胞焦亡和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂DMEM培养基购于美国HyClone公司，胎牛血清购于美国Gibco公司。NaB和MTT购于美国Sigma-Aldrich Chemical公司，TMZ购于美国MCE公司。结晶紫试剂选购于中国北京索莱宝科技有限公司，Transwell系统购于美国Corning公司，Matrigel试剂购于美国BD Biosciences公司。BCA试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒均购于中国上海碧云天生物技术有限公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于中国翌圣生物公司。NLRP3、IL-1β、GSDMD和β-actin抗体均购于美国Abcam公司。

1.2 NaB作用浓度的筛选人U251胶质瘤细胞自美国类型培养物收集中心获取。将U251细胞按5 000个/孔接种于96孔板，用含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基，于37 ℃和体积分数5%CO2的保湿培养箱中培养过夜。分别加入2.5、5.0、10.0和20.0 mmol/L NaB刺激24 h，将原培养基弃除，更换为MTT溶液处理4 h，吸除MTT溶液并添加DMSO，置于摇床振荡10 min。以未加NaB处理的细胞为空白对照。应用酶标仪检测样品在570 nm处的吸光度，细胞活性=实验组吸光度/空白对照吸光度×100%。选取适宜浓度用于后续实验。

1.3 实验分组将U251细胞分别用100 μmol/L TMZ、10 mmol/L NaB、两者联合(同时加药)处理，以未加药处理的细胞为空白对照。处理24 h后进行各项指标的检测。

1.4 细胞迁移能力的测定将U251细胞按1×105个/孔接种于6孔板内，待细胞融合度达90%左右时，用200 μL无菌移液枪头垂直于6孔板内进行划痕，用PBS清洗并更换基础培养基，立即拍摄划痕照片，此时计为0 h。之后按1.3分组处理，每组3孔。24 h后再次拍摄划痕照片，用Image J软件处理图像并计算迁移率，实验重复3次。迁移率=(0 h划痕宽度-处理后划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.5 细胞侵袭能力的测定将Transwell小室上室用Matrigel包被，于下室中加入600 μL完全培养基。将U251细胞用无血清培养基混匀，按5×104个/孔接种到上室，按1.3分组处理24 h后，将下室用多聚甲醛固定20 min，以结晶紫染色，最后于倒置显微镜下成像。选取3个200倍视野计数细胞，取平均值，即为侵袭细胞数。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡检测将U251细胞按1×105个/孔接种于6孔板内，按1.3分组处理24 h。收集细胞并用PBS清洗3遍，加PI和Annexin V-FITC染色15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7 细胞中ROS生成量的检测U251细胞按1×105个/孔接种到24孔板中，按1.3分组处理24 h。之后将细胞与10 μmol/L DCFH-DA充分混匀，于37 ℃避光环境中孵育20 min，用PBS清洗3次，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.8 细胞中GSDMD、NLRP3和IL-1β蛋白的检测将U251细胞按每孔1×105个接种于6孔板内，按1.3分组培养24 h。收集细胞，在低温环境中用RIPA缓冲液提取蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。使用100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，BSA封闭膜1 h，4 ℃环境中加GSDMD、NLRP3、IL-1β(均按1∶1 000稀释)及β-actin(1∶5 000稀释)抗体孵育12 h，室温下加二抗孵育1 h，成像仪中扫描显影。其中GSDMD抗体可显示出GSDMD、GSDMD-N两种蛋白。将所得图片用Image J软件进行灰度值分析，以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达量。实验重复3次。

1.9 统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析，4组U251细胞的迁移率、侵袭细胞数、细胞凋亡率、ROS生成量，以及GSDMD、GSDMD-N、NLRP3和IL-1β蛋白表达水平的比较采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NaB作用浓度的筛选不同浓度NaB作用后，U251细胞活性测定结果见图1。根据图1，后续实验选择10 mmol/L NaB处理细胞。

*:与0.0 mmol/L组相比，P<0.05

2.2 NaB联合TMZ对U251细胞迁移、侵袭能力及ROS生成的影响4组细胞迁移和侵袭实验结果见图2、3。4组细胞迁移率、侵袭细胞数及ROS生成量的比较见表1。可以看出，NaB与TMZ均能抑制U251细胞的迁移和侵袭能力，促进U251细胞ROS的生成,两者联合作用效果更强。

图2 4组U251细胞迁移实验结果

图3 4组U251细胞侵袭实验结果

表1 4组U251细胞迁移率、 侵袭细胞数及ROS生成量的比较

2.3 NaB联合TMZ对U251细胞凋亡的影响由表2可知NaB与TMZ均能促进U251细胞凋亡，两者联合作用更强。

2.4 NaB联合TMZ对U251焦亡的影响由图4和表3可知，TMZ与NaB均能促进细胞中GSDMD蛋白的解离及炎症蛋白IL-1β及NLRP3的表达，两者联合作用更强。

表2 4组U251细胞凋亡率的比较

1：空白对照组；2：TMZ组；3：NaB组；4：联合作用组

表3 4组U251细胞焦亡相关蛋白表达水平的比较

3 讨论

手术联合放化疗是现阶段治疗胶质瘤的主流手段，化疗药物耐药是胶质瘤治疗需要面对的重要问题[2]。TMZ很容易穿透血脑屏障，通过诱导不依赖于DNA损伤的应激反应来介导细胞凋亡，是临床上治疗脑肿瘤最有效的药物之一，但使用剂量较高，易产生明显的毒副作用[6]。所以，如何提高其疗效同时降低毒性是目前研究的重点。越来越多的研究[10-11]表明，NaB是一种潜在的抗癌药物，在结肠癌、乳腺癌、胶质瘤等显示出治疗效应[12-15]。NaB与其他药物联合治疗脑肿瘤是一个可行的选择[16-17]。研究[4,14]发现， NaB可以通过打开胶质瘤线粒体膜上的通透性转换孔，引起细胞内线粒体质子漏增多，进而引起胶质瘤细胞的凋亡，并且这一凋亡现象与NaB提高腺嘌呤核苷酸转位酶-2的表达相关。

本研究结果显示，NaB在体外可以抑制U251细胞的增殖、侵袭和迁移能力，诱导U251细胞凋亡，并且NaB与TMZ联合作用效果更显著。细胞焦亡是一种有炎症小体参与的细胞程序性死亡[18]，活化的GSDMD/GSDME蛋白导致细胞膜孔的形成，最终致使细胞涨破，促进IL-1β和IL-18的释放和活化[19]。有研究[20]表明GSDMD的过度表达与胶质瘤的分级以及不良预后有关。细胞焦亡是一种高度敏感的过程，ROS可以调节细胞焦亡[21]。本研究结果显示，NaB与TMZ联合作用后U251细胞GSDMD-N蛋白和炎症蛋白IL-1β及NLRP3表达升高，表明NaB与TMZ联合可以促进U251细胞中GSDMD介导的细胞焦亡。

本实验结果支持NaB与TMZ联合作用增加U251细胞凋亡和焦亡的假设。因此，NaB与TMZ联合使用可能是治疗胶质瘤的一种可选途径。