郝世娟，宋静蕾，裴家伟，郭润芳

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

三型抗性淀粉（resistant starch type 3，RS3），又名抗酶解淀粉、难消化淀粉，是将淀粉颗粒在一定温度以下糊化而后在低温下冷却形成，是安全性较高的一种物理变性淀粉[1-2]。由于其热稳定性好、抗酶解以及多种营养保健功能而备受关注[3]。RS3除了具备其他类型抗性淀粉的降血糖血脂[4]、改善肠道微环境[5]、促进有益菌生长[6]及预防疾病[7]等生理功效，还具有结构紧密、热稳定性高、持水性低、色泽白皙、无异味、口感细腻等优势[8]，在食品研究与生产中应用潜力大，因此开发不同来源的RS3备受国内外学者和加工企业关注。

甘薯是我国主要的粮食作物之一，含有丰富的营养成分和生物活性物质。甘薯种类较多，有淀粉型、鲜食型、饲用型等不同用途的品种，甘薯生长周期短、价格低廉，工业应用的潜在供应量大、成本低[9]。目前高淀粉型甘薯主要用于生产淀粉，而甘薯淀粉被用于甘薯粉丝（条）加工或被用作食品添加剂，如增稠剂和稳定剂，但由于其具有易降解、稳定性低等特点，在食品加工业有一定局限性。而且甘薯淀粉加工仍处于初级阶段[10]，产品形式单一、营养开发不全面、资源浪费严重。甘薯中的直链淀粉含量高达17.5%～26.7%[11]，高含量直链淀粉是制备抗性淀粉的前提。利用甘薯淀粉制备RS3，不仅丰富甘薯淀粉加工产品种类、提高甘薯淀粉的附加值，而且也能拓宽其应用范围，对于延长甘薯加工产业链、促进农民增收、企业增效具有重要意义。因此，本研究以淀粉型甘薯为原料，通过单因素试验研究不同处理条件对RS3得率的影响，然后利用响应面分析法优化甘薯RS3制备工艺，并对甘薯RS3的体外消化特性及其结构表征进行分析，为甘薯RS3在食品中的合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯（冀薯98）：金沙河集团-红薯岭农业开发有限公司；pH1.5 KCl-HCl缓冲液、pH6.9 Tris-Maleate缓冲液、pH4.75醋酸钠缓冲液：河北农业大学粮油大分子生物加工实验室自制；胃蛋白酶（3 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；α-淀粉酶（10 000 U/g）：邢台万达生物科技有限公司；胰酶（4 000 U/g）：阿拉丁试剂有限公司；猪胰α-淀粉酶（50 000 U/g）：合肥博美生物科技有限公司；糖苷酶（100 000 U/mL）、溴化钾（光谱纯）：上海麦克林试剂有限公司；酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、苯酚、亚硫酸钠、浓盐酸（均为分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钙（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

水浴恒温振荡器（THZ-82A）：常州润华电器有限公司；紫外可见分光光度计（UV752N）：上海佑科仪器仪表有限公司；环境扫描电镜（Prisma E）：北京欧波同光学技术有限公司；傅里叶红外光谱仪（FLAME-NIR）：美国海洋光学公司；X-射线扫描（TD-3700）：丹东通达科技有限公司。

1.3 试验方法

制备工艺流程：甘薯去皮切块→打浆过滤→滤液冷藏（4℃）静置24 h→弃上清、水洗沉淀→50℃烘干→粉碎过筛→甘薯原淀粉→用水调制淀粉乳→调pH值→压热一定时间→冷却至室温（约25℃）→4℃冷却回生24 h→70℃烘干→粉碎过筛→甘薯RS3粉。

1.3.1 甘薯原淀粉（native starch，NS）的制备

甘薯清洗干净后，去皮切成小块，放入打浆机，加适量蒸馏水后打浆并用纱网过滤，用蒸馏水多次冲洗滤渣直至滤液无白色淀粉颗粒，合并滤液后于4℃冰箱静置24 h，弃去上层液体，沉淀用蒸馏水洗涤2次～3次，同样条件静置，弃上清液，于70℃烘箱烘干后粉碎即为甘薯原淀粉。

1.3.2 甘薯RS3的制备

RS3制备基础条件为12%淀粉乳（甘薯原淀粉/蒸馏水），用KCI-HCI缓冲液调节pH值为7.0，于灭菌锅121℃处理15 min，冷却至室温（约25℃）后，置于4℃冷却回生24 h，70℃烘干后粉碎并过100目筛，即为甘薯RS3。

1.3.3 单因素试验

在基础制备条件下，分别研究淀粉乳浓度（4%、8%、12%和 16%）、pH 值（3、5、7、9和 11）、压热温度（100、110、115、120 ℃）、压热时间（15、25、35、45、55 min）以及冷却回生时间（12、24、36、48、60 h）对 RS3 得率的影响，每个试验重复3次。

1.3.4 响应面试验

通过单因素试验分析，选择对RS3得率影响较大的淀粉乳浓度、pH值、压热温度和压热时间（编号分别为 A、B、C、D）4 个因素作为因子，RS3 得率为响应值，进行响应面优化试验，确定制备甘薯RS3的最优工艺条件，响应面因素水平见表1。

表1 响应面因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.5 RS3得率的测定

采用 Goñi法[12]结合 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dintrosalicylic，DNS）法测定样品中的还原糖含量，再换算成RS3含量，计算公式如下。

式中：W为甘薯RS3得率，%；M为由标准曲线求得的样品中还原糖含量，mg；M0为淀粉样品的干质量，mg。

1.3.6 抗消化特性

1.3.6.1 抗酶解特性

参考Miao等[13]的方法略作修改。分别称取200 mg甘薯NS和RS3，加入20 mL醋酸钠缓冲液（pH4.75）混匀，沸水浴糊化后于90℃水浴保温30 min，取出晾至室温（约25℃）加入5 mL混合酶液（含猪胰α-淀粉酶600 U/mL，糖苷酶 15 U/mL），分别在 0、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min 时取出，沸水浴灭酶 10 min后8 000 r/min离心15 min，采用DNS法测定上清液还原糖含量，根据如下公式计算样品中快速消化淀粉（rapidly digestig starch，RDS）、慢速消化淀粉（slowly digestig starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS）含量及各个时间段的水解率。

式中：G0、G20、G120分别为消化 0、20、120 min 时释放的还原糖含量，mg；Gt为t时刻上清中还原糖含量，mg；TS为总淀粉质量，mg；m 为淀粉样品质量，mg。

参照Goñi等[14]的方法，0～90 min计算样品的水解指数（hydrolysisindex，HI）和预测血糖指数（forecast glycemic index，eGI），HI以葡萄糖为参比样品。计算公式如下。

1.3.6.2 体外模拟消化

3种消化液（人工唾液、人工胃液、人工小肠液）及三段式体外消化模型参考Bornhorst等[15]的方法并略作修改。分别称取100 mg甘薯NS和RS3样品于1号～14号离心管中，加入1 mL蒸馏水混匀，沸水浴糊化后于90℃水浴中保温30min，取出冷却至室温（约25℃），用超声波粉碎仪粉碎；口腔段消化：加入1 mL人工唾液，37℃水浴振荡90 s，取出1号管；胃部消化：2号～14号管立即用2mol/L盐酸调节pH值至2.0，加入2mL人工胃液，37℃水浴振荡1h，分别在20、40、60min时取出2号～4号管；小肠段消化：5号～14号管用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，加入4 mL人工小肠液，37℃水浴振荡 3h，分别在 10、20、30、40、50、60、90、120、150、180 min时取出；每次取出离心管后立即沸水浴灭酶10 min，8 000 r/min离心15 min，用DNS法测定上清液中还原糖含量，计算样品水解率和经不同部位消化后的失重率，计算公式如下。

式中：GT为T时刻上清液中还原糖含量，mg；M为样品质量，mg；MP为经不同部位消化后的剩余淀粉质量，mg。

1.3.7 结构表征

1.3.7.1 扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）检测

将干燥NS、RS3样品均匀分散在粘有导电胶的载物台上，真空条件下喷金固定120 s后在扫描电镜中观察，分别拍摄放大600×、5 000×的清晰照片。

1.3.7.2 傅里叶红外光谱（Fourier transform infraredv spectrometer，FT-IR）检测

将干燥的NS、RS3样品分别与溴化钾以1∶100质量比研磨后压片测试，溴化钾为背景，扫描范围4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率 4 cm-1。

1.3.7.3 X-射线衍射（X-ray diffraction，XRD）测定

将NS、RS3粉末放入样品槽铺平，置于样品台进行扫描，采用Cu-Ka靶，设置电压25 kV，步长0.02 s，测量角度2θ为4°～40°，根据如下公式计算结晶度（Xc）[16]。

式中：Ac为结晶区面积；Aa为非晶区面积。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行方差分析和最小显著性检验（least significant difference，LSD），Origin 2019软件绘图，利用软件Design-expert 8.0中的Box-Behnken Design设计法对29个试验组合进行回归分析拟合，所有的试验数据均为3次重复试验的平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

不同因素对RS3得率的影响见图1。

图1 不同因素对RS3得率的影响Fig.1 Effect of different factors on the extraction yield of RS3

2.1.1 淀粉乳浓度对RS3得率的影响

由图1A可以看出，RS3得率随淀粉乳浓度的增大先升高后降低，淀粉乳浓度为12%时得率最大，为（29.91±0.16）%，淀粉乳浓度过高过低均会影响RS3得率，因此选择8%、12%和16%进行后续的响应面优化试验。

2.1.2 pH值对RS3得率的影响

由图1B可以看出，RS3得率随pH值的增大先升高后降低，pH5时得率达到最高值（30.35±0.12）%，明显高于其他pH值。因此选择pH3、5、7进行后续响应面优化试验。

2.1.3 压热温度对RS3得率的影响

由图1C可知，随着压热温度的升高，RS3得率增大，在 110℃时达到最大值（32.78±0.13）%，当温度升高到115℃时，RS3略有减少，120℃时显著降低（p＜0.05）。适宜的压热温度有助于淀粉糊化，强化RS3的生成，然而当压热温度过高时，会使淀粉颗粒破裂，淀粉分子逸出，导致螺旋结构中的部分氢键断裂，范德华力被削弱[17]，难以形成RS3。综合考虑，选择100、110、120℃进行后续的响应面优化试验。

2.1.4 压热时间对RS3得率的影响

由图1D可以看出，在一定的时间内，RS3得率随着压热时间的延长而升高，这可能是由于直链淀粉逐渐释放，分子之间相互接近易于形成RS3，35 min后继续延长压热时间，RS3得率降低。因此，压热时间为35 min时效果最好，选择25、35、45 min进行后续的响应面优化试验。

2.1.5 冷却回生时间对RS3得率的影响

由图1E可以看出，冷却回生时间低于24 h时，RS3得率增长明显，超过24 h后，RS3得率增长缓慢，在48 h得率最高，这种变化符合晶核形成理论[18]。因此，考虑到经济效益的问题，后续的响应面优化试验冷却回生时间选择24 h。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

制备工艺Box-Behnken试验设计及结果见表2。

表2 制备工艺Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken test for extraction process

续表2 制备工艺Box-Behnken试验设计及结果Continue table 2 Design and results of Box-Behnken test for extraction process

采用Box-Behnken中心组合设计法对29组试验数据进行回归分析，得到回归方程：得率=38.31+1.85A+0.016B-1.85C+0.65D+1.62AB-0.32AC-0.75AD-1.74BC-0.30BD+0.54CD-3.47A2-2.52B2-4.51C2-2.31D2。该方程的校正决定系数R2=0.951 0，说明该模型能精确预测响应值。方差分析见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

续表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance

由表3可知，影响甘薯RS3得率大小的因素依次为压热温度＞淀粉乳浓度＞压热时间＞pH值；利用De sign-expert软件的响应面结果预测得到甘薯RS3的最优制备工艺条件为淀粉乳浓度13%、pH5.38、压热温度107.5℃、压热时间35.47 min，此条件下RS3得率为38.86%。

2.2.2 最优工艺条件验证

考虑到实际操作条件，将预测的工艺参数调整为淀粉乳浓度13%、pH5.5、压热温度110℃、压热时间35 min，此条件下进行3组重复试验，得到RS3得率为37.94%，与预测值仅相差0.92%，表明实际试验结果与预测值接近，表明采用响应面法优化甘薯RS3的制备工艺具有可靠性。

2.3 抗消化特性测定结果

2.3.1 抗酶解特性

RS3、NS的消化水解率见图2。NS和RS3中的RDS、SDS、RS含量、HI、eGI以及三段式消化失重率见表4。

表4 NS和RS3中的RDS、SDS、RS含量、HI、eGI以及三段式消化失重率Table 4 RDS，SDS and RS content，HI，eGI and three-stage digestion weight loss of NS and RS3

图2 RS3、NS的消化水解率Fig.2 Digestible hydrolysis rate of RS3 and NS

淀粉根据其水解速率可分为快速消化淀粉（RDS）、慢速消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）[19]。由图2A可以看出，前20 min内酶解快速，RS3的水解率为24.31%，对照NS的水解率达到81.52%，此部分属于快速消化淀粉RDS；超过20 min后水解速率增长缓慢并在120 min后趋于平稳（p＞0.05），整体来看，RS3的水解率（31.43%）远低于对照NS（90.42%），可见RS3主要成分是抗性淀粉，而甘薯原淀粉NS中主要是快速消化淀粉RDS（表4），这可能与其形态结构有关，原淀粉的无定形结构更容易被α-淀粉酶降解[20]；而RS3为B+V型结晶，双螺旋程度和结晶度高，结构紧密，α-淀粉酶无法进入结晶区内部水解其中的α-1，4糖苷键。甘薯NS的eGI为83.49，RS3为53.71，根据Jenkins等[21]提出的概念，甘薯天然淀粉为高血糖指数食品（eGI＞70），RS3为低血糖指数食品（eGI＜55），因此，RS3在进入人体后具有较慢的消化吸收速率，不会引起血糖迅速升高，有利于餐后血糖平稳。

2.3.2 体外模拟消化

图2B显示，RS3和NS在口腔的水解率分别为19.77%和48.65%；进入胃部消化后，pH2的环境抑制了α-淀粉酶的活力，RS3和NS在胃部消化后与口腔消化后失重率差值仅为0.5%和1.0%；在进入小肠后的水解率基本稳定，RS3和NS在240 min时消化率分别为31.99%和70.77%，且RS3在口腔、胃部、小肠段消化的失重率均小于NS，RS3展现出比NS更强的抗消化性，这与样品的酶解特性结论一致。结果表明，甘薯RS3可以抵抗小肠中消化酶的消化而进入结肠，具备在结肠被发酵、充当益生元的潜能。

2.4 结构特性

2.4.1 扫描电镜观察

图3分别为两种淀粉放大600倍和5 000倍的扫描电镜图。

图3 NS、RS3的扫描电镜图Fig.3 SEM images of NS and RS3

如图3所示，RS3和甘薯原淀粉NS的颗粒形态差异明显，NS多为表面光滑，球形或近球形，而甘薯RS3多为不规则块状，且表面凹凸不平，颗粒相对较大。这是因为在压热法制备RS3的过程中，直链淀粉浸出，在冷却回生过程中重新结合而失去了支链淀粉结晶区[22]，纯化过程中α-淀粉酶除去其表面的直链淀粉和支链淀粉，形成层状条带[23]，RS3的紧密结构使其具有更强的抗酶解性。

2.4.2 X-射线衍射

NS、RS3的X-射线衍射图谱见图4。

图4 NS、RS3的X-射线衍射图谱Fig.4 X-ray diffraction pattern of NS and RS3

淀粉由无定形、亚结晶和结晶结构组成[24]，XRD衍射图谱中的衍射峰可反映淀粉的无定形结构和微晶结构。如图 4 所示，RS3 在 14.5°、17.0°、22.2°、23.7°处产生衍射峰，为典型的B型结晶，结晶度为22.87%；NS在 15.1°、17.3°、18.1°和 23.2°出现明显的衍射峰，天然的甘薯淀粉为A型结晶，结晶度为18.41%，说明压热冷却回生处理可促使甘薯淀粉由A型向B型结晶转变，并伴有部分V型结晶形成，这与Guo等[25]的报道一致；不同晶型酶解性能不同，其中A型淀粉抗酶解能力最弱，V型结晶抗酶解能力最强[26]，这也是甘薯RS3具有更强抗消化能力的原因。

2.4.3 傅里叶红外光谱

RS3、NS的红外光谱图见图5。NS和RS3的DO、DD值以及结晶度见表5。

图5 RS3、NS的红外光谱Fig.5 Infrared spectrogram of RS3 and NS

表5 NS和RS3的DO、DD值以及结晶度Table 5 DO，DD values and crystallinity of NS and RS3

由图5可知，相较于原淀粉NS，RS3的红外光谱图中个别吸收峰发生位移，如NS中1 080、1 157 cm-1处的吸收峰转变为RS3中的1 078、1 153 cm-1处吸收峰，说明甘薯淀粉经过压热后伯-仲醇羟基相连的C-O和吡喃糖环的C-O发生了伸缩振动。经过压热后的淀粉在1 022、1 153、1 240 cm-1处吸收强度增加，说明这两个键收缩振动加强；波长1 050 cm-1～950 cm-1与淀粉的有序和非晶结构有关[27]，其中1 047、1 022 cm-1和995 cm-1为反映淀粉结构变化的3个主要吸收峰，常用DO值和DD值来表示淀粉颗粒的有序度和双螺旋结构程度[28]，如表5所示，压热处理使淀粉颗粒脱支糊化、导致有序度降低，直链淀粉在低温下重新聚集成更为紧密的双螺旋结构，从而抵抗酶解消化。

3 结论

本文以甘薯淀粉为原料，采用压热法制备抗性淀粉RS3，通过单因素和响应面优化试验得出，影响甘薯RS3得率大小的因素依次为压热温度＞淀粉乳浓度＞压热时间＞pH值。利用压热法制备甘薯RS3的最优工艺条件为淀粉乳浓度13%、pH5.5、压热温度110℃、压热时间35 min，然后冷却至室温（25℃）后，置于4℃冷却回生24 h，此条件下的RS3得率为37.94%，与预测值接近；经过压热回生处理后，RS3结晶度提高，结构更加紧密，因此比NS更能抵抗酶的水解；RS3酶解120 min仍保留31.43%，属于抗性淀粉，经过模拟口腔、胃部、小肠消化，失重率为31.99%，而保留下来的抗性淀粉能够进入结肠发挥作用；本研究建立的甘薯抗性淀粉RS3制备工艺易于实现规模化操作，得率高，抗性淀粉含量高，抗消化能力强，在甘薯深加工产业以及食品配料中的应用前景广阔。