周明敏 黄鹤

肠道菌群能利用宿主食物中的膳食纤维、益生元和部分乳制品,通过各种代谢途径产生短链脂肪酸(SCFA)。SCFA是少于6个碳原子的有机脂肪酸,生理p H 值下SCFA 主要以共轭碱形式存在于盲肠和结肠中,主要包括丁酸盐、乙酸盐和丙酸盐[1]。研究发现,SCFA 作为信号分子可参与宿主免疫、炎症、能量代谢、情绪、认知、行为、记忆等多种生物学过程,与机体多个系统疾病的发生、发展密切相关,包括代谢性疾病、肠道疾病、心血管疾病、行为认知障碍疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病等[2-3]。近来诸多研究发现SCFA 对自主神经系统,尤其是对心脏自主神经系统存在作用,笔者就SCFA 与心脏自主神经系统的关系进行综述。

1 肠道SCFA经肠-脑轴的心血管保护效应

微生物-肠-脑轴作为神经-体液通讯网络,可维持机体稳态,其主要由肠道菌群、肠神经系统、中枢神经系统(例如旁巨细胞外侧核/头端延髓腹外侧区)和自主神经系统(包括交感神经和副交感神经系统)组成。肠道管腔和/或粘膜内的SCFA 短期可调节肠道神经元功能,改变神经元兴奋性;SCFA 如果长时间作用,可改变神经元形态、基因表达和兴奋性[4-5]。SCFA 兴奋肠道迷走传入神经中的SCFA 受体(包括GPR41和GPR43),经由肠-脑轴调节宿主交感和副交感神经系统活性,间接参与心脏自主神经调控而发挥心血管保护作用[4-9]。

长链脂肪酸和SCFA 均可激活迷走传入神经纤维,但其具体作用机制不同。Lal等[4]将雄性Wistar大鼠分为对照组、胆囊收缩素A(CCK-A)受体阻断剂组和膈下迷走神经离断组,依次记录大鼠在1 m L生理盐水、油酸钠和丁酸钠(均为10 mmol/L)腔内灌注过程中肠迷走传入神经的放电情况,较生理盐水灌注而言,油酸钠(143%±13%vs 114%±5%,P＜0.05)或丁酸钠(524%±144%vs 114%±5%,P＜0.05)灌注均可明显增加肠迷走传入神经放电;此外较生理盐水灌注而言,油酸钠的神经激活效应可被CCK-A 受体阻断剂或膈下迷走神经离断所阻断(CCK-A 阻断剂:111%±4%vs 110%±2%,P＞0.05;膈下迷走神经离断:102%±9%vs 108%±6%,P＞0.05),但丁酸钠的神经激活效应在CCK-A 阻断剂或钙通道拮抗剂(L 型、N 型和P/Q 型拮抗剂,与肠道平滑肌活动和肠道神经递质释放相关)预处理肠腔后仍存在(CCK-A 阻断剂:337%±67%vs 110%±2%,P＜0.05;钙通道拮抗剂:189%±22%vs 109%±5%,P＜0.05),其神经激活效应可被膈下迷走神经离断所阻断(102%±4% vs 108%±6%,P＞0.05)。Tolhurst等[10]添 加1 mmol/L乙酸盐或丙酸盐可增加野生型小鼠结肠组织中胰高血糖素样肽1(GLP-1)水平(约增加60%),而小鼠GPR43敲除会降低其结肠组织中丙酸盐诱导的GLP-1 增加(降低70%),对乙酸盐的刺激则无反应。Krieger等[11]进一步发现,较对照组而言,腹腔注射GLP-1(33μg/kg)可抑制雄性SD 大鼠的食物摄入(约降低1h食物摄入的60%)和胃排空速度(约降低20 min后对乙酰氨基酚血清浓度的43%),而敲除双侧迷走传入神经节(结状神经节)中GLP-1受体可消除GLP-1对大鼠食物摄入和胃排空的抑制作用。据此笔者推测SCFA 如丁酸盐对迷走传入神经有直接和间接双重作用,其直接作用是直接刺激迷走传入神经,间接作用是通过SCFA 受体增加GLP-1等胃肠激素的释放以间接激活迷走传入神经。

SCFA 可快速并持久的激活迷走传入神经,亦可改变宿主基因表达。Goswami等[12]腹腔分别注射3 种SCFA(6 mmol/kg)后10 min即可抑制禁食后雄性C57小鼠的食物摄入,其作用强弱分别为丁酸盐＞丙酸盐＞乙酸盐,较生理盐水腹腔注射后标准粉状饮食CE-2的摄入相比,3种SCFA分别抑制其0.5 h CE-2摄入量的50%、40%和30%,而全身性辣椒素预处理或肝迷走神经离断术可通过中断迷走传入神经以消除SCFA 对小鼠食物摄入的抑制作用。给予雄性SD 大鼠抗性淀粉饮食2周可增加肠腔内丁酸盐浓度[(46.2±7.7)μmol/g vs(20.1±4.5)μmol/g,P＜0.05],与常规饮食大鼠相比,抗性淀粉饮食增加大鼠肠道乙酰胆碱酯酶(Ch AT)阳性肠道神经元比例(约增加35%),因此其神经介导的结肠收缩反应增强;直接添加丁酸盐(0.5 mmol/L)至大鼠原代肠神经细胞中,可增加肠神经元中组蛋白H3K9的乙酰化程度、Ch AT 的m RNA 水平以及Ch AT 阳性神经元比例,而给予Src激酶抑制剂(PP2 或SU6656)可抑制原代肠神经细胞的上述变化,推测丁酸盐所介导的胆碱能神经元增加可能与Src激酶信号通路和组蛋白H3K9的乙酰化相关,提示SCFA 可影响宿主基因表达[5]。

外源性肠相关神经元是由肠道相关的感觉传入神经和肠道自主神经传出神经组成,主要包括结状神经节、背根神经节以及腹腔-肠系膜上交感神经神经节(CG-SMG)[13]。Muller等[14]给予SPF级小鼠广谱抗生素(饮用水中,2 周)或链霉素(单次20 mg,24 h)后,由肠道微生物群耗竭所致的SCFA 缺失可显著增加CG-SMG 中c-fos阳性神经元数目(提示肠道外交感活性增强),而经口管饲含SCFA 的水溶液或三丁酸甘油酯(丁酸盐前体物质)24 h即可抑制口服链霉素所致肠道微生物群耗竭后CG-SMG 中c-fos阳性神经元数目的增加(提示其交感神经活性被抑制),作者进一步将表达红色荧光蛋白的伪狂犬病病毒注射至小鼠的回结肠并结合脑干免疫荧光染色以逆向示踪CG-SMG 上游的神经核团(即旁巨细胞外侧核/头端延髓腹外侧区),并推测SCFA可能是通过肠道迷走传入神经纤维影响中枢的旁巨细胞外侧核/头端延髓腹外侧区,最终抑制CG-SMG 的活性。

心肌缺血会过度激活心脏交感神经系统,其中星状神经节(SCG)是心脏交感神经通路的主要干线,室旁核(PVN)是重要的心脏交感神经中枢核团。Yu等[9]将雄性SD 大鼠分为假手术组,心肌缺血/再灌注(I/R)组,I/R＋丁酸盐组,I/R＋丁酸盐＋迷走神经离断组,发现连续饮用4周含丁酸盐的饮用水(200 mmol/L)显著抑制大鼠I/R 后心脏交感神经活性的增加(表现为较I/R 组,其PVN 和SCG 中c-fos活性降低、血清去甲肾上腺素水平降低以及心率变异性中低频成分和低频/高频成分比值降低)并显著降低心肌组织丙二醛水平、超氧化物歧化酶活性以及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达;但膈下迷走神经离断将消除丁酸盐对大鼠心肌I/R 后交感神经元活性、氧化应激和凋亡等病理生理机制的影响,提示丁酸盐可能激活肠迷走传入神经并经肠-脑神经通路以减少心脏交感神经活性、氧化应激以及凋亡,发挥预防心肌I/R 后损伤的作用。张蓉等[15]进一步将雄性SD 大鼠分为假手术组、I/R 组、I/R＋丁酸钠组和I/R＋丁酸钠＋迷走神经离断组,在大鼠I/R 后给予2 m L 丁酸钠(17.5 mg/kg)灌胃,观察其I/R 后24 h的相关指标,发现丁酸钠可降低大鼠I/R 后24 h的血清去甲肾上腺素水平[(1.1±0.1)ng/m L vs(2.0±0.2)ng/m L,P＜0.05]、心率变异性中低频成分以及低频/高频成分比值[低频成分(nu):(3.8±2.1)vs(16.9±2.8);低频/高频成分:(0.05±0.03)vs(0.25±0.05)]和梗死面积(11.2%±2.2%vs 31.3%±7.6%),而迷走神经离断可消除上述丁酸钠的治疗作用。Onyszkiewicz等[16]静脉注射1.4 mmol/kg丁酸盐至麻醉的雄性Wistar大鼠,可使其平均动脉压(MAP)显著降低(约降低25 mm Hg,30 min恢复基线水平),但大鼠心率未受影响;结肠直接给予5.6 mmol/kg丁酸盐可产生更持久的血压和心率下降(MAP 约降低20 mm Hg,心率约降低40次/分,90 min仍无恢复趋势),而膈下迷走神经离断或非特异性GPR41/GPR43拮抗剂预处理结肠后,结肠丁酸盐的降压和降心率作用显著减弱,因此推测肠道内的丁酸盐可通过GPR41/GPR43受体兴奋迷走传入神经纤维,发挥降低血压和心率的作用。Zhou等[8]将雄性SD 大鼠分为假手术组,假手术＋丙酸盐组,心肌梗死组和心肌梗死＋丙酸盐组,发现心肌梗死后持续饮用含丙酸盐(200 mmol/L)的饮用水4周可显著增加慢性心肌梗死大鼠结状神经节(迷走传入神经节)和孤束核(迷走神经中枢核团)中c-fos的表达,并增加血清中乙酰胆碱水平[(201.9±24.4)pg/m L vs(121.4±13.0)pg/m L]和升高心率变异性指标中高频成分(反映迷走传出神经活性),继而改善心肌梗死大鼠心室复极化离散度[有效不应期离散度:7.1%±3.7%vs 25.1%±7.3%,P＜0.05;Tp-Te间期:(37.2±3.1)ms vs(46.9±2.7)ms,P＜0.05]和梗死周边区域缝隙连接蛋白43的侧边化(12.5%±2.1%vs 23.3%±3.6%,P＜0.05),最终降低心肌梗死大鼠室性心律失常诱发率(心室颤动诱发率:20%vs 56%),提示口服丙酸盐作为一种营养干预措施,可通过肠-脑轴以激活副交感神经系统发挥心血管保护作用。

2 循环SCFA对心脏自主神经系统的直接作用

心血管疾病中肠道微生物稳态的破坏以及肠道屏障完整性的降低可导致血液SCFA 浓度升高,以增强SCFA 对心脏自主神经的直接作用[17-18]。GPR41在自主神经节(交感神经节、椎前神经节和迷走神经节)、躯体感觉神经节(脊髓背根和三叉神经节)乃至门静脉血管上广泛表达,SCFA 可直接作用于GPR41 受体以影响机体的自主神经功能[19]。由于自主神经分布广泛,各个器官之间亦相互影响,故循环血液中SCFA 对心脏自主神经系统的效应是综合且复杂的。

Kimura等[6]腹腔注射丙酸盐(1 g/kg)至野生型和GPR43敲除小鼠中,可致野生型小鼠心率显著增加(15 min约升高35次/分),腹腔注射β受体阻滞剂普萘洛尔(4 mg/kg)可抑制上述反应,但丙酸盐未能改变GPR41敲除小鼠的心率;丙酸盐(10 mmol/L)可直接诱发小鼠离体SCG 神经元的细胞外动作电位并增加与SCG 神经元共培养的心肌细胞搏动率,而敲除GPR41基因、使用Gβγ阻滞剂(Gallein)、siRNA 基因沉默PLCβ或ERK1/2均可抑制上述丙酸盐所致的现象,证实循环中的丙酸盐可通过GPR41受体在交感神经节水平激活心脏交感神经活性,而该效应与SCG 中Gβγ-PLCβ-MAPK 信号通路相关。Poll等[20]使用无线电遥测技术持续记录C57小鼠清醒状态下的右侧颈动脉血压和心率,作者腹腔注射1 g/kg的乙酸盐可显著升高小鼠血浆乙酸盐水平[注射15 min后:(14.9±1.8)mmol/L vs(0.16±0.03)mmol/L],并在注射3～5 min后使其MAP[最低下降(52.2±12.1)mm Hg,较基线降低44%]和心率[最低下降(252.8±54.3)次/分,较基线约降低37%]显著降低;提前腹腔注射选择性β1受体阻滞剂阿替洛尔(2 mg/kg)10 min后再行腹腔注射乙酸盐,较仅注射乙酸盐,小鼠的MAP 下降水平相似[(63.3±15.6)mm Hg vs(52.2±12.1)mm Hg,P＞0.05]而心率下降水平明显减弱[(158.3±41.6)次/分vs(252.8±54.3)次/分,P＜0.05];为明确乙酸盐的直接心脏效应,作者使用乙酸盐(10 mmol/L)和生理盐水持续灌注离体心脏,与盐水灌注相比,持续灌注乙酸盐10 min后其心率无显著差异[(314±26)次/分vs(341±57)次/分,P＞0.05],灌注30 min 后心率方显著降低[(275±21)次/分vs(354±39)次/分,次/分,P＜0.05,较基线下降22%]。Jiang等[21]将雄性SD 大鼠分为假手术组,心肌梗死组和心肌梗死＋丁酸盐组,于大鼠冠状动脉结扎后每日腹腔注射丁酸盐(1 mol/L),发现丁酸盐可抑制心肌梗死大鼠梗死周边区TNFα、IL-1β和IL-10等炎症因子水平,促进M2巨噬细胞极化,降低梗死周边区去甲肾上腺素、生长相关蛋白43和酪氨酸羟化酶等交感神经重构指标,并降低PR 间期、QJ间期和室性心律失常诱发率(18.2%vs 75.0%,P＜0.05)。

丁酸盐可穿过血脑屏障而直接作用于中枢神经系统,Xu等[22]腹腔注射丁酸钠(2.5 g/kg)至C57小鼠后,发现小鼠脑组织丁酸盐水平显著升高(10 min达到峰值5μmol/g,半衰期120 min),而其脑内γ氨基丁酸和谷氨酸等神经递质水平显著降低。Yang等[23]观察侧脑室直接注射丁酸盐对Wistar-Kyoto大鼠血压的影响,发现注射1μL 丁酸盐(1 mmol/L)后400 s大鼠血压下降(7.56±2.13)mm Hg,注射后1000 s血压降低(20.02±1.05)mm Hg;进一步的功能性磁共振成像发现侧脑室注射丁酸盐主要影响下丘脑和脑干等心血管中枢。但既往研究也发现单侧杏仁核显微注射乙酸盐(0.20μmol/100nl)显著增加雄性SD 大鼠麻醉状态下内脏交感神经放电(增加72%±13%)、腰交感神经放电(增加62%±12%)和MAP[增加(5±2)mm Hg],而N-甲基-D-天门冬胺酸受体拮抗剂可抑制乙酸盐的上述反应,作者推测因乙酸盐与谷氨酸羧基末端具有结构同源性,故其可通过局部的N-甲基-D-天门冬胺酸受体激活交感神经[24]。

3 展望

过去几十年里,微生物组学研究发展迅速,成为临床前和临床研究的热点话题。在高通量测序等技术的帮助下,宿主-微生物的相互作用不断被发现,并明确肠道微生物是影响哺乳动物生理、病理的重要因素之一。肠道微生物稳态失衡可致其代谢物在胃肠道、血浆和大脑中发生浓度和成分的变化,其中SCFA 作为重要的生理调节剂。高血压、冠心病或心力衰竭等心血管疾病下宿主常伴随肠道菌群失调,可导致肠道SCFA 浓度减少及成分变化[25],而自主神经将肠道菌群及其代谢产物变化与心血管疾病的发生、发展联系在一起。自主神经系统调控宿主各个系统器官的生理功能和病理进展,尤其在心血管疾病中有着重要的作用[26]。在正常或疾病模型中,研究肠道菌群代谢物SCFA 结合肠道等特定组织器官上的受体,探究其结合受体后对心脏自主神经以及心血管疾病发生、发展的影响,可发现潜在的病理机制及新的干预靶点。摄入益生菌(双歧杆菌或乳酸菌)、膳食纤维、口服补充各类SCFA、SCFA 前体物质或菊粉丙酸酯(仅在菊粉被结肠微生物代谢后才会释放与之结合的丙酸酯,以实现结肠的定向释放)等措施,均是可广泛普及且易开展的干预措施,也有待后续研究发现更多的干预手段[27-28]。