马 莉，陈健鑫，康定旭，李鸿博，刘 亭，伍建榕，马焕成*

(1.西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，西南林业大学 林学院，云南 昆明 650224； 2.云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，西南林业大学 生物多样性保护学院，云南 昆明 650224)

木棉(Bombaxceiba)是木棉科(Bombacaceae)一种落叶深根大乔木，主要生长在热带及亚热带地区。木棉不耐寒、不耐水湿、喜光耐热，在微酸性或中性土壤中生长良好，是热带的特征科树种，多见于干热条件明显的干热河谷地区。木棉花期在冬季，花大且美观，树体高大且枝叶繁茂，适宜种植于光照条件好的地区，是行道树的首要选择。木棉花、叶等部位有较高的经济价值和药用价值，是干热河谷地区重要的经济树种之一[1]。

在干热河谷地区，降雨量少且气候炎热，光热条件充足，气温年差小，土壤浅薄，植被生长困难，生态环境极其脆弱。而木棉则对干热河谷的干旱环境有较高适应性，对防止水土流失和恢复生态环境都具有重要作用。

根际微生物是土壤-植物根系中重要的组成部分，参与有机物质与无机物质的代谢与转化，促进植物对土壤养分的吸收与利用，调控植物的生长发育与免疫进程[2]。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)隶属于球囊菌门(Glomeromycota)，是一类专性活体营养共生菌，AMF能与80%的陆生维管植物形成共生关系[3]，可以影响植物的生物量变化、提高植物的水分代谢量、植物对重金属、盐渍等污染物的抗逆能力以及改善土壤结构性质，还可以保持植物群落体系的稳定性、多样性，在恢复土地，改善农业生产以及生态环境的恢复和稳定方面都发挥着不可替代的作用[4]。马坤等[5]研究发现，AMF改善了木棉根区土壤和植株体内的养分状况。研究接种AM真菌与干旱胁迫下的植物还有发现，AMF可提高生物量缓解不同器官水分含量的降低[6-7]。在不同区域，木棉在AMF的影响下均长势良好，木棉对不同生境的广域适应性是否与其共生的AMF差异性有关是本研究关注的焦点。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

干热河谷地区气候炎热，光热条件充足，气温年较差小，但因为降水少、土层浅薄，导致植被生长困难，生态环境较为恶劣，属于生态脆弱地区。我国干热河谷主要位于西南地区(23°00′-28°10′ N，98°50′-103°50′ E)，集中分布于横断山脉的金沙江、澜沧江、元江、怒江流域以及珠江流域[8]。

金沙江流域以元谋县为例，位于云南省境内楚雄州西北部，以山地为主，东南高，西北低，属亚热带季风气候，半干旱区域；元江流域以元阳县为例，位于云南省境内红河州的南部，以山地为主，气候为亚热带山地季风，属于半湿润区；澜沧江流域以西双版纳地区为例，位于云南省境内北回归线以南的热带湿润季风区，属于湿润区；珠江流域以广西崇左为例，位于广西西南部，主要是山地丘陵，气候为亚热带季风，属于湿润区；怒江流域以保山潞江坝为例，位于云南省境内的滇西部，以山地为主，气候属亚热带季风，为半干旱区。

1.2 样品采集

2019年12月-2020年2月，在云南和广西崇左5个典型干热河谷流域中人为干扰较少的地段采集木棉根际土样和根样(表1)。

每个流域采用五点法取样，在每个采样点以木棉树根部为中心的东、南、西和北4个方位去除表面的枯叶及表层腐土后，均匀采集木棉根际5～30 cm土层土壤共1 kg，同时在4个方位剪取木棉的须根。土壤样品放入低温泡沫盒，根系样品放入FAA固定液中保存，样品保存于西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室进行后续试验。

1.3 AMF孢子的分离

采用略改动的湿筛沉淀法分离土壤中的AMF孢子[9]。方法：称取20 g土样，浸泡于500 mL蒸馏水中，适度搅拌后静置过夜。用缓慢流水冲洗土样，使其通过40、100、140、200目和300目的细筛，后用蒸馏水收集筛面颗粒，置于体视镜挑取各筛目下的孢子并统计数量。

1.4 AMF孢子的鉴定

分离出来的AMF孢子用Melzre’s试剂作为浮载剂，在光学显微镜(品牌Leica，型号DM750)下观察拍照，根据孢子的颜色、形态大小、孢壁厚度等数据，参考Schenck等[10]和相关学者的文献[11-12]，对筛选出来种、属的孢子进行检索、鉴定。

AMF分子鉴定的方法：在无菌工作台上挑取单个AMF孢子，用无菌水充分漂洗3次后转移至无菌的1.5 mL离心管，用OMEGA微量DNA抽提试剂盒提取单孢子总DNA，在-20 ℃保存备用。以单孢子总DNA为模板进行巢氏PCR(Nested-PCR)扩增，PCR扩增采用50 μL体系，第1轮PCR的产物稀释30倍作为第2轮PCR模板[10]。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增正确的条带委托昆明擎科生物科技有限公司进行双向测序，测通的序列进行拼接，并通过邻接法(neighbor-joining method，NJ)，以1 000作为Bootstrap校验值，构建系统发育树，确定AMF的分类地位(表2)。

1.5 AMF多样性分析

用湿筛法分离得到的AMF孢子进行个数、种类及分离频率等数据记录，通过计算真菌孢子密度、Margalef物种丰富度指数和Shannon-Wiener指数分析AMF多样性指标[13]。

孢子密度(spore number，SN)

SN=某土样中AM真菌孢子数/土样数

(1)

物种丰富度指数(Margale，R)

R=(S-1)/lnN

(2)

Shannon-Wiener指数

pi=某AMF真菌孢子占该流域所有孢子的比例

(3)

式中:S为物种的数量，pi为种的个体占全部个体的比例。

1.6 菌根侵染率分析

根据Grace等[14]的方法做略微改动：取出FAA固定的木棉须根，用蒸馏水清洗干净，加入15%的KOH于90 ℃水浴解离2 h至根系透明，冷却后用水清洗4～5次，加入2%的乳酸软化，后用5%的苯胺蓝溶液90 ℃水浴染色40 min，用乳酸甘油脱色后制成临时玻片，在光学显微镜下观察并记录菌丝、泡囊和丛枝等结构，并计算菌根侵染率[13]。

菌根侵染率=菌根侵染的交叉点数和/总交叉点数×100%

(4)

2 结果与分析

2.1 木棉根际AMF的分离

从5种典型干热河谷流域的木棉根系中分离的孢子总共7科7属17种，其中，球囊霉属5种：凹坑球囊霉(Glomusmultiforum)(图1A)、层状球囊霉(G.lamellosum)、地球囊霉(G.geosporum)、大果球囊霉(G.macrocarpum)、单孢球囊霉(G.monosporum)；根生囊霉属2种，透光根生囊霉(Rhizophagusdiaphanws)(图1B)和聚丛根孢囊霉(R.aggregatnm)，盾巨孢囊霉属2种：黑盾果孢囊霉(Suctellosporanigra)和美丽盾巨孢囊霉(S.calospora)(图1C)；和平球囊霉属1种玻利维亚和平球囊霉(Pacisporaboliviana)(图1D)；无梗囊霉属4种：大型无梗囊霉(Acaulosporacolossica)(图1E)、孔窝无梗孢囊(A.foveata)，蜜色无梗囊霉(A.mellea)，皱壁无梗囊霉(A.rugosa)；多样孢囊霉属2种：幼套多孢囊霉(Diversisporaetunicaum)和沙生多样孢囊霉(D.arenorio)(图1F)；巨孢囊霉属1种：易误巨孢囊霉(Gigasporadecipiens)。

通过湿筛分离土壤孢子并进行形态鉴定，发现球囊霉属和无梗囊霉属的种类较多，分别有5种和4种。统计各个流域AMF孢子种类，根生囊霉属、玻利维亚和平球囊霉和易误巨孢囊霉只在珠江流域出现。金沙江、怒江、澜沧江、红河在地形上属于横断山脉地区，具有相似的AMF物种组成，而珠江流域属于云贵高原，具有特殊的AMF组成，其中根生囊霉属、玻利维亚和平球囊霉和易误巨孢囊霉在其他流域没有出现(表2)。

2.2 AMF单孢子的分子鉴定

以单孢子总DNA为模板进行Nested-PCR实验扩增出500～750 bp的目标产物(图2)，拼接后的序列提交至NCBI数据库进行比对，结果显示目标产物与球囊霉目的真菌具有较高的相似度。

将目标序列与NCBI数据库中同源性较高的序列构建系统发育树(图3)，结果显示AMF孢子系统发育树上聚为两大进化支，其中BS001与MT108833P.scintillans聚为一支，支持率87%，相似性98.0%；GX002与FJ009672S.calospora聚为一支，支持率97%，相似性99.90%；YM001与FJ009670A.mellea聚为一支，序列支持率95%，相似性97.50%；YY001与AB326023Glomussp.聚为一支，支持率为99%，相似性为100%；BN002与HF970325Rhizophagussp.聚为一支，支持率100%，相似性99.80%；GX001与MT765703D.sporocarpia聚为一支，支持率95%，相似性为98.80%；BN001与AJ504639.1G.rosea聚为一支，支持率100%，相似性98.90%。

注：A.凹坑球囊霉(G.multiforum) B.透光根生囊霉(R.diaphanws)C.美丽盾巨孢囊霉(S.calospora) D.玻利维亚和平囊霉(P.boliviana) E.大型无梗囊霉(A.colossica) F.沙生多样孢囊霉(D.arenorio)

表2 不同流域AMF种类统计

图2 部分AMF孢子电泳图谱

图3 基于AM真菌18SrDNA基因序列的系统发育树

2.3 木棉的根系侵染率的测定

丛枝和泡囊是AMF真菌定殖植物根系的重要结构，苯胺蓝染色后镜检发现，木棉根系中发现菌丝、丛枝及泡囊等结构(图4)，说明木棉与丛枝菌根真菌互利共生。金沙江、元江、澜沧江、怒江、珠江流域木棉根系AMF侵染率分别是67.50%、66.20%、43.30%、42.83%和31.00%(表3)。

AMF侵染率的数据统计及显著性分析结果表明，干热地区的元江流域和金沙江流域侵染率较高，半干旱区的澜沧和怒江流域的侵染率居中，而湿润区的珠江流域AMF侵染率较低，不同流域的AMF菌根侵染率存在差异。

2.4 不同流域木棉根际土样AM真菌多样性分析

干热条件突出的金沙江流域孢子密度35.07个·g-1，丰富度23.00种，Shannon指数2.80；相似条件下的元江流域孢子密度34.98个·g-1，丰富度22.92种，Shannon指数2.69；半湿热的澜沧江流域孢子密度27.68个·g-1，丰富度16.17种，Shannon指数2.60；相似条件下的怒江流域孢子密度29.50个·g-1，丰富度17.00种，Shannon指数2.40；湿润条件下的珠江流域孢子密度18.52个·g-1，丰富度12.00种，Shannon指数2.18(表3)。

结果表明，干热条件突出的金沙江流域和元江流域AMF孢子密度高于半湿润及湿润流域区；AMF孢子丰富度在干热条件突出的金沙江流域指数较高；Shannon-Wiener指数结果显示，金沙江流域和元江流域指数较高，且不同流域间存在显著性差异。

图4 木棉根系皮层细胞中共生的AMF泡囊、菌丝及丛枝结构

表3 不同流域菌根真菌侵染率、土样孢子密度、种的丰度和Shannon指数

2.5 不同流域影响因子与AMF多样性的主成分分析

AMF多样性各项影响因子指标的公因子方差较大，其中经度的公因子方差最小为0.783。按照特征值>1的原则，提取了2个主成分(3.615和1.695)。这2个主成分的贡献率为57.669%和30.829%，累计贡献率88.498%(>85%)，说明这2个主成分是AMF多样性变化的影响因素(表4)。

表4 AMF多样性影响因子载荷矩阵及主成分贡献率

由主成分的初始因子载荷矩阵可见，纬度、海拔、年均降水量、年均蒸发量与第1主成分呈正相关，经度、年均温度与第2主成分呈正相关，即纬度、海拔、年均降水量、年均蒸发量可作为AMF多样性的主要指标。说明干热河谷与经纬度有关的地带性气候和与海拔有关的局部地形对该地区的AMF多样性有直接的影响。

3 结论与讨论

从不同流域干热河谷地区木棉根际土壤里分离出7科7属17种丛枝菌根真菌，其中球囊霉属及无梗囊霉属为干热河谷地区AMF的优势群落。研究证实了在干热河谷地区木棉根系能与AMF建立共生关系。且在不同水热条件下，AMF孢子密度、菌根侵染率及孢子多样性也有差异，整体看，各流域木棉根系中AMF孢子密度、菌根侵染率及孢子多样性在干热地区>半湿润地区>湿润地区。景跃波[15]研究发现云南热区西南桦根际AMF优势类群为球囊霉属，伍建榕等[16]研究发现，在云南干热河谷地区摩西球囊霉与幼套球囊霉孢子数量较多，频率更高，前人研究证实了球囊霉属真菌具有较强的环境适应能力和繁殖特性[17]，本研究对干热河谷木棉根系AMF优势种的研究也与前人的结果相符。琚淑明等[18]研究表明，喜树在干旱胁迫下接种AMF降低膜透性，提高水分利用率，进而提高抗旱能力。胡亚军[19]研究表明，在北方干旱与半干旱草原中AMF菌丝密度与年均温显著正相关，且在贫瘠的土壤中AMF的生物量增加。大量研究表明，干旱条件下，AMF通过提高多样性来适应环境从而促进植物的生长。

金沙江、怒江、澜沧江、红河在地形上属于横断山脉地区，具有相似的AMF物种组成，而珠江流域属于云贵高原，具有特殊的AMF组成，其中根生囊霉属、玻利维亚和平球囊霉和易误巨孢囊霉在其他流域没有出现。这种现象说明与地形有关的气候因素对AMF组成产生直接影响。本研究从不同环境因子主成分分析得出，纬度、海拔、年均降水量、年均蒸发量均可以影响AMF的种类及多样性。且由主成分的初始因子载荷矩阵可以看出，纬度、海拔、年均降水量、年均蒸发量与第1主成分呈正相关，经度、年均温度与第2主成分呈正相关，即纬度、海拔、年均降水量、年均蒸发量可作为AMF多样性的主要指标。说明干热河谷与经纬度有关的地带性气候和与海拔有关的局部地形对该地区的AMF多样性有直接的影响。在横断山脉地区的流域范围内，气候相对干旱，干热河谷地区海拔较低，年降水量较小，则AMF孢子密度较大。而云贵高原的珠江流域海拔较高，降水丰富，AMF的多样性出现下降现象。前人的研究发现，随着海拔的升高，AMF 群落多样性呈现下降的趋势[20]，AMF的物种多样性的多个指标都与年均降水量与蒸发量呈正相关[21]。

目前，AMF真菌的鉴定大多基于形态描述与核糖体rDNA片段的分子鉴定，但在近缘种属的区分中是充分的。随着测序技术的发展，基因的扩增及高通量测序技术在近缘种属的区分中显示出了更大的优势[22-24]。AMF与植物根系形成共生系统，增强植物的抗旱性与抗逆性等促进植物的生长发育，这对生长在干热河谷地区的植物尤为重要[25-26]。木棉生长过程与AMF相互联结影响关系密切。韦素贞等[27]研究发现，接种AMF可改善宁夏枸杞营养状况及光能效率，提高抗逆性，有利于在干旱环境中生长。在干热条件突出的金沙江流域和元江流域，AMF多样性和菌根侵染率较高，随着AMF多样性和侵染率的增加，有助于木棉对土壤中P元素的吸收，又促进侧根生长，即增加根系的表面积，改善木棉根系对土壤养分的吸收与利用[28]。木棉之所以能在干热河谷区稳定生存并建立较稳定的种群，与丛枝菌根抗旱性与抗逆性有密切的关系。干热条件下木棉受到的干旱胁迫越强，植物生存所需水分更多，因此土壤丛枝菌根侵染率及AMF多样性提高能增强木棉的抗逆性，保证木棉在干热条件下维持生长。赵高卷等[29]研究发现木棉在不同的环境中均可以生长，在困难的环境中产生抗旱能力。张菲等[30]发现，枳在干旱条件下，AM真菌参与植物生长，改变植物体内激素平衡，增强植物抗旱性。大量研究已证实，AMF对促进植物生长，改善植物品质，增强植物对水分、养分的吸收和提高植物的抗逆性等有显著作用[13]。研究也将为后续在干热河谷中木棉的生长与AMF多样性研究提供理论依据。