白淑艳，王鹏，陈中祥，吴松，郝其睿，高磊，杜宁宁，覃东立*

（1 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 哈尔滨1500702 2 农业农村部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（哈尔滨），哈尔滨 150070）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）俗称河蟹，因独特的风味和富含多种矿质元素[1]，而深受消费者喜爱，现已成为我国主要的水产品养殖品种。中华绒螯蟹自然群体主要分布在我国的长江、黄河和辽河流域及河口等水域[2]，目前以养殖群体为主，其中，稻田养蟹作为一种可持续的水稻生态种养模式，是中国北方稻作区一种重要的种养模式[3-4]。如辽宁省盘锦市是我国北方最大的河蟹养殖基地。稻田养殖的鱼、虾、蟹等品质优良，味道鲜美，深受广大消费者欢迎[5]。目前，申请国家地理标志产品保护的中华绒螯蟹品牌有20 多个，包括辽宁东港、阳澄湖、洪泽湖、黄河口等。然而，由于品牌蟹具有较高的商业价值，贴错标签和掺假等问题时有发生，严重扰乱了水产品市场。研究鉴别中华绒螯蟹产地的溯源方法，对规范生产，维护市场秩序，加强监管具有重要意义。

食品产地溯源有许多不同的生物和化学方法，如利用色谱、质谱和光谱学原理分析食品中的有机（DNA、蛋白质、脂质、糖和代谢物）和无机（元素、同位素比例）组分的差异性来进行辨别[6-7]。随着分析检测技术的发展，矿物元素指纹图谱技术结合化学计量学分析在食品产地溯源方面得到广泛的应用，例如在谷物[8-10]、牛羊肉[11-13]、葡萄酒[14-16]等食品溯源中的应用。也有学者基于多元素指纹结合化学计量学方法对水产品进行产地溯。例如：郭利攀[17]利用电感耦合等离子体-质谱仪（ICPMS）测定东海3 个地区经济鱼类的25 种金属元素，结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行产地判别，实现了97.92%的正确分类。张政权等[18]通过测定肌肉组织 中K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu、Fe 8种矿物元素含量和碳、氮稳定同位素丰度，结合多元统计分析方法建立了针对来自崇明、阳澄湖和兴化3 个地区的中华绒螯蟹的产地判别模型，判别准确率达98.3%。骆仁军等[19]结合矿质元素和稳定同位素技术对黄河和辽河3 个产地的中华绒螯蟹进行产地鉴别，结果表明稳定同位素和矿质元素相结合或单独利用矿质元素的判别准确率均高于95%，且稳定同位素和矿质元素的结合具有更高的产地区分潜力。Marrà 等[20]、Kang 等[21]、Gopi等[22]、Li 等[23]采用ICP-MS 结合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、线性判别分析（LDA）、支持向量机（SVM）、逐步线性判别分析（S-LDA）等方法对鲈鱼、海参及虾等水产品进行产地溯源，判别效果较好。当前对中华绒鳌蟹的产地溯源研究多集中在长江、黄河水系，且以野生和池塘养殖为主[13-14，24]，缺乏北方地区以及稻蟹共作模式下中华绒螯蟹群体的鉴别，导致其在认证和可追溯体系中不全面。本研究以北方稻蟹共作养模式下中华绒螯蟹为样本，采用ICP-MS对样本进行矿质元素指纹分析，结合方差分析、PCA、OPLS-DA 以及S-LDA 等方法进行产地溯源，以期为建立国家地理标志中华绒螯蟹的产地溯源体系提供基础资料和方法参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

优级纯硝酸和盐酸，德国Merck 公司；Li、Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu、Bi 内标溶液质量浓度为100 mg/L，Li、Y、Ce、Tl、Co 调谐液质量浓度为10 mg/L，美国Agilent 公司；V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Ba、Pb 和U 标准溶液质量浓度为1 000 mg/L，国家标准物质中心；高纯氩气、高纯氦气（纯度≥99.999%）。

ICP-MS（7500cx），配置八级杆碰撞/反应池系统（ORS），美国Agilent 公司；微波消解仪MARSX，美国CEM 公司；纯水器，美国Millipore 公司。

1.2 样本采集与制备

稻蟹共作模式下中华绒螯蟹样本共计36 份，于2017 年9 月采集自辽宁省盘锦市，吉林省长春市、四平市和吉林市，黑龙江省佳木斯市、绥化市和虎林市。其中黑龙江省10 份，吉林省16 份，辽宁省10 份。所有样本大小相似，雄性和雌性样本数量相同。雌蟹体重68～130 g，雄蟹体重82～155 g。样本采集后独立密封包装于样本袋中，采用带有冰盒的保温箱尽快低温运输至实验室。样本制备前，用吸水纸去除样本体表水分，去壳，取可食部分，混合并均质，存于-20 ℃冰箱，备测。

1.3 样本检测

样本检测方法参考覃东立等[25]的方法。所用塑料瓶、锥形管等玻璃器皿均用浓HNO3浸泡24 h，超纯水冲洗3 遍，烘干，备用。常温下解冻样本，用微波消解。每个样本称取0.5 g（湿重），放至2.5 mL 65%硝酸中，加入0.5 mL 37%盐酸和7.0 mL超纯水。微波消解的程序：微波功率1 600 W，爬升温度185 ℃，升温时间10.5 min，保持时间14.5 min。消解完成后，将消解液移至50 mL 容量瓶中，加入0.5 mL 100 μg/L 内标溶液，定容50 mL。同时，做样本空白溶液，消解后的中华绒螯蟹样本和试剂空白用ICP-MS 检测。

1.4 数据分析

采用SPSS 20.0（美国IBM 公司）软件进行相关性、差异性和主成分分析以及逐步线性判别分析；采用R 语言建立正交偏最小二乘判别模型；采用Origin9（美国Originlab）软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 不同省份中华绒螯蟹样本中元素含量差异性及相关性分析

由表1 可看出，所有中华绒螯蟹样本中Cd、Pb、As、Cr 和Cu 等重金属含量范围远低于GB 2762-2017《食品中污染物限量》[26]对甲壳类水产品的限量标准。方差分析结果显示：Cr、Mn 元素在3 个省份样本中均存在显著差异（P＜0.05），2 种元素平均含量水平在3 个省份样本间的排序均为：吉林省＜辽宁省＜黑龙江省，吉林省平均含量水平最低。吉林省V、Fe、Ba、Pb 4 种元素极显著低于黑龙江省和辽宁省（P＜0.01），而Ni、Mo、Cd、U 4种元素极显著高于黑龙江省和辽宁省（P＜0.01），As 元素显著高于黑龙江省和辽宁省（P＜0.05），以上9 种元素在黑龙江和辽宁省的样品间无显著差异（P＞0.05）。辽宁省样本中Zn 元素的含量极显著低于黑龙江省的，而黑龙江和吉林两省样本间无显著差异。Co、Cu、Se、Ag 4 种元素含量在3 个省份样本间均差异不显著（P＞0.05）。3 省份样本中元素含量存在地区性差异，利用这种差异对样本进行产地鉴别具有可行性。

表1 3 个省份中华绒螯蟹样本矿物元素含量及变异系数Table 1 Mineral element content and coefficient of variation of Eriocheir sinensis samples from three provinces

对16 种元素数据做标准化处理，然后进行相关性分析，结果见表2。V、Cr、Mn、Fe、Ba 5 种元素与U 元素呈极显著负相关（P＜0.01），而与Ba、Pb呈极显著正相关，元素U 与Ni、As、Se、Mo、Cd 呈极显著正相关，与Pb 呈极显著负相关关系；元素Ba、Pb 与Ni、Mo、Cd 呈极显著负相关；元素Mn 与Cd、Mo、As、U，Cd 与V、Cr、Fe，Mo 与V、Cr、Cu，Cu与Ni 均呈极显著负相关；Cd 与Ni、Mo，Mo 与Ni、As，Se 与Cu、As，Ag 与Cu 均呈极显著正相关关系，还有部分元素间呈显著的相关关系（P＜0.05）。以上结果表明，中华绒螯蟹样品中大部分元素含量间存在密切的联系，由于信息重叠，很难看出元素间整体的关联性。作为统计分析的第1 步，采用无监督主成分分析法将数据进行降维处理，找出元素间的关联规律，并对样本进行初步分类判别。

2.2 不同省份中华绒螯蟹样本中元素含量的主成分分析（PCA）

将中华绒螯蟹样本中的元素含量数据做标准化处理后进行主成分分析。结果表明，第1 主成分F1的特征值为2.70180，方差贡献率为45.620%；第2 主成分F2特征值为1.65770，方差贡献率为17.180%；第3～5 主成分F3～F5的方差贡献率分别为9.615%，8.283%，7.404%（表3）。前5 个主成分累计方差贡献率为88.101%（大于85%），说明前5 个主成分能够解释全部样本的16 个元素指标的绝大部分信息。

表3 主成分的方差贡献率Table 3 Eigenvalues and contribution rates to total variance of principal components

由主成分载荷网络图可以看出（图1），F1主要综合了样本中V、Cr、Mn、Fe、Pb 含量信息，F2主要综合了样本中Cu 含量信息，F3主要综合了样本中Co 含量信息，F4主要综合了样本中Ag 含量信息，F5主要综合了样本中Zn 含量信息。结合以上结果，V、Cr、Mn、Fe、Pb、Cu、Co、Ag、Zn 等9 种元素是不同省份中华绒螯蟹的特征元素。

图1 主成分载荷网络图Fig.1 Principal component load network diagram

根据主成分分析的结果，将全部样本的前2个主成分得分作二维散点图（图2），对样本初步分类。可以看出，吉林省样本分布虽较分散但仍可被归为一类，而黑龙江省和吉林省样本有部分重叠。可能是因为前2 个主成分的累计方差贡献率只有62.80%，原始信息代表度不高。无监督PCA虽然在视觉上对中华绒螯蟹的地理来源进行模糊分类，但是需要建立判别模型对3 个省份样本做准确判别。

图2 不同省份中华绒螯蟹矿物元素含量在前2 个主成分得分的散点图Fig.2 Scatterplots of the first 2 principal components of mineral elements in Eriocheir sinensis from different provinces

2.3 不同省份中华绒螯蟹样本中矿物元素含量的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

为了实现对不同省份中华绒螯蟹的产地判别，对样本的16 种矿质元素含量进行OPLS-DA分析，构建溯源模型，其拟合参数R2X=0.572，R2Y=0.75，即57.2%的变量可以解释75%的组间差异，经七折交叉验证后，估计模型的预测能力为71.4%，证明该模型具有较好的预测能力（R2 和Q2 均大于0.5）。由图3看出3 个省份的样本达到明显的聚类，表明不同省份中华绒螯蟹样本的元素含量具有一定的特征性，使各省份样本得到有效的分类。变量投影影响指数（variable importance for the projection，VIP）显示（图4），Zn、Cr、Mn、Pb、V、Mo、Fe、U 的VIP 值均大于1，一般情况下VIP 值可量化各变量对样本分类的贡献，VIP 值越大（＞1），对产地判别的差异性越显著[27]，表明Zn 等8 种矿质元素含量对3 个省份中华绒螯蟹样本的产地判别贡献率较大，尤其是Zn、Cr、Mn 的VIP 值分别为1.796，1.227，1.223，表明这3 个元素可作为3 个产区样本鉴别的特征元素。

图3 3 个省份中华绒螯蟹的OPLS-DAFig.3 OPLS-DA plot of Eriocheir sinensis from the three provinces

图4 OPLS-DA 模型下的变量投影影响指数（VIP）值Fig.4 Variable importance in the projection（VIP）obtained from the OPLS-DA mode

2.4 不同省份中华绒螯蟹中矿物元素含量的逐步线性判别分析（SLDA）

LDA 是一种有监督的数据分类方法，可以在假设样本分类的前提下将已知样本作为训练集，利用不同类别样本之间的相关性建立判别模型，再用判别模型对未知样本进行判别归类。采用“留一法”进行交叉验证，即把训练集中除某个样本之外的其余样本作为训练集，建立相关的判别函数，进而对该样本进行判别。像这样，将每个样本作为一个测试集，来验证由剩余其它样本所建立的判别函数，从而检验判别模型的稳定性。采用逐步判别分析（S-LDA）方法，按照中华绒螯蟹样本中各元素含量在判别分析过程中的重要性，由大到小逐步选为判别变量，

建立中华绒螯蟹分类判别函数。各省份中华绒螯蟹的产地判别公式如下：

由此可见，Cr、Zn、Mo、Ag、Pb、U6 种元素的含量作为特征因子被引入判别函数中，将6 种元素含量数值分别带入上式，可计算出3 个函数值。选取其中函数值最大的判别函数所对应的省份作为该个体的产地，对观测样本进行预测分类。结果表明，各省份判别结果的正确率均为100%（表4）。采用“留一法”进行交叉验证，结果显示：黑龙江省的1 个样本被误判为辽宁省，另两个省份实现了全部100%的预测分类，其总体的交叉验证判别正确率为97.2%。

表4 判别函数的预测分类及判别准确率Table 4 The predicted classification and accuracy of discriminant function

本次判别分析采用矿质元素建立两个典型判别式函数（Fuction1、Fuction2），其中Fuction1 的方差贡献率为 97.1%，Fuction2 的方差贡献率为2.9%，将Fuction1、Fuction2 分别做横坐标和纵坐标建立坐标系，得到3 个省份样本的散点图5。可以直观看出3 个省份的所有样本均被分为3 个区域，说明建立的判别函数对这3 个省份的样本具有很好的分类效果。

图5 典型判别式函数分类图Fig.5 Classification diagram of typical discriminant functions

3 讨论

多种化学计量学方法结合多元素指纹技术在对水产品产地判别中发挥重要作用[20-23]。本研究中不同地区的中华绒螯蟹样本大部分元素含量存在显著差异，单凭一个变量是不可能确定其产地的。本文采用3 种分析方法（PCA、OPLS-DA 和SLDA）结合矿物元素含量数据，对北方稻蟹共作模式下中华绒螯蟹进行产地判别。在此过程中，无监督PCA 仅提供部分不同地理来源的中华绒螯蟹样本的模糊视觉分类。这是因为原始数据中的很多信息在降维过程中丢失了，前两个主成分总共解释约62.8%的数据变化。然而，PCA 作为统计分析中的第1 步，找到元素之间的关联规律对于初步数据分析和数据可视化是必要的。监督LDA 和OPLS-DA 方法是鉴别中华绒螯蟹样品本地理来源的有效方法。在3 个省样品的判别分析中，SLDA 和OPLS-DA 模型能够实现100%的正确分类。综上，多元素含量结合LDA 和OPLS-DA 可以实现中华绒螯蟹的产地鉴别。

本研究中，3 种分类方法（PCA、OPLS-DA 和S-LDA）筛选出的特征元素均包含元素Zn、Cr、Pb，可见，这3 种元素在3 个省份中华绒螯蟹产地判别中具有一定的地域表征性，可作为潜在的鉴别标记变量。本研究中，所有中华绒螯蟹样本中Cd、Pb、As、Cr 和Cu 等重金属含量范围远低于GB 2762-2017《食品中污染物限量》[26]对甲壳类水产品的限量标准。重金属是典型的累积性污染物，污染具有持久性，被水产动物摄食后，经食物链逐级传递、富集，可与有机物结合成毒性更大的化合物[28-29]。例如，Cd 危害性极大，会使动物体内钙大量流失，引起病体骨质疏松、萎缩，与含羟基、巯基的蛋白质结合，抑制酶系统的正常功能，被机体吸收的镉很少能排除体内[28，30]。在地壳中，Pb 作为重金属里含量最多的元素，进入动物体内后，会随血液分布，储存于器官中，引起神经炎等各种疾病[31]。然而，有研究表明，Pb、Cr 等重金属在甲壳纲十足目水产动物组织内具有特殊的生物学意义，它们储存在甲壳动物体内可满足动物的生理需求[31]。也有研究指出Pb、Cd、As、Hg 等重金属元素的含量可能与环境污染有关[32]。黑龙江省、辽宁省与吉林省稻田养殖河蟹中Cr 含量的差异与本地区土壤中Cr 含量的差异相关联[25]，可进一步研究重金属的来源，以确定Pb、Cd 等元素指纹在中华绒螯蟹产地判别中的地域表征性。

与池塘养殖或野生[18-19，24]的中华绒螯蟹样本元素含量相比，北方稻蟹共作模式下的中华绒螯蟹样本中Zn 的含量更低。养殖螃蟹可捕食自然食物来源，主要摄食鱼类、贝类和商业颗粒饲料等外源饲料[33]。由于饲料配方中使用的原料不同，添加特定的宏量或微量矿物元素（富含Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Cr 和Mg），以及饲料成分中可能存在的污染物，导致鱼类饲料中的矿物元素含量水平差异极大[34]。北方稻蟹共作模式下的中华绒鳌蟹多以当地玉米为饲料，其元素含量更多地反映地域环境的信息，而受颗粒饲料等外源饲料影响较小。总之，中华绒螯蟹元素含量指纹特征是养殖水环境、底泥、饲料等多方面因素综合影响的结果，需进一步探究其形成原因。

4 结论

采用ICP-MS 测定了黑龙江、吉林省和辽宁省共36 个中华绒螯蟹样本中的V、Cr、Mn 等16种元素含量，结果显示：3 个省份间中华绒螯蟹样本 中V、Cr、Ni、Mn、Zn、Ba、Fe、Mo、Cd、As、Pb 和U元素的含量差异显著（P＜0.05），其中，大部分元素之间表现出极显著的相关关系。利用矿物元素含量特征，结合PCA、OPLS-DA 和S-LDA 等方法，对中华绒螯蟹样本进行产地判别。由于数据信息损失较大，PCA 方法在区分地理来源方面效果不佳。S-LDA 和OPLS-DA 方法初始判别正确率均为100%，交叉验证结果显示OPLS-DA 预测能力为71.4%，S-LDA 判别准确率高达97.2%。此外，基于3 种分类方法，确定了Zn、Cr、Pb 元素含量是3 个省份中华绒螯蟹产地鉴别的关键特征因子。然而，地理来源、水环境及饲料种类等对中华绒螯蟹元素含量的影响还有待深入研究。因本研究的样品数量和产地来源较少，故使试验结果存在局限性。今后需扩大采样量和采样地区，优化统计方法，筛选并建立更有效的溯源指标体系和判别模型。