丁健美，刘之熙

（湖南省水稻研究所/农业部长江中下游籼稻遗传育种重点实验室，湖南长沙 410125）

品种鉴定是种子市场监管和品种审定准入的主要内容，是育种工作的重要阶段，也是衡量成果能否转化的重要环节。因此，品种鉴定在种子生产、加工、储藏及经营贸易等流通过程中具有重要意义和应用价值。但在种子流通中，为节省成本与缩短时间周期，往往忽略品种鉴定的重要性，导致仍有种子掺假的案件发生，给生产造成了难以挽回的损失[1]。杂交水稻是我国最主要的农作物，对保障国家粮食安全起到举足轻重的作用，因此，随着全国杂交水稻种植面积比重逐年增大，对杂交水稻种子的质量（主要是真实性和纯度）检查和监督尤为重要。目前，杂交水稻品种鉴定的方法主要有形态鉴定法、生化鉴定法、DNA 分子技术鉴定法。

1 形态鉴定法

1.1 种子形态鉴定法

种子形状比较稳定，故形态鉴定方法简单，快速经济。主要通过观察种子的外观形态特征，包括种子的长宽度与大小、形状、颜色、光泽、种皮形态、垩白、胚乳等性状，借助仪器或工具（如放大镜、解剖镜等）观察，进行品种鉴定，一般情况下可鉴定出杂交水稻样品的真实性[2-3]。但由于这些性状只适用于品种间差异较大的样品鉴定，且受鉴定者经验的制约，品种鉴定结果可靠性较差，应用范围较窄。

1.2 幼苗形态鉴定法

在相同条件的温湿度、光照等环境下，对种子进行培养，当发芽良好的种子生长发育到适合鉴定的幼苗阶段，结合独特的形态特征进行比较鉴定。李稳香等用幼苗形态鉴定法，发现应用于鉴定威优、汕优、协优系统的杂交一代均有较好效果，尤以鉴定威优46效果与田间种植鉴定结果均基本一致[4]。此鉴定方法较简单，易于操作，成本低，鉴定周期短，鉴定结果较准确。但由于幼苗期所依据的性状有限，且受种子处理方法与生长环境的影响颇大。因此，该鉴定方法只适用于幼苗形状差异较明显的品种。

1.3 田间种植鉴定法

田间种植是鉴定品种最为可靠的方法之一，主要依据品种的特征特性进行鉴定。将种子适时催芽、播种，秧苗栽插到田间，通过水肥管理、病虫害预防等，直到抽穗时进行鉴定。我国每年冬季都会在海南岛进行田间种植鉴定，这种鉴定方法比较简单，鉴定结果较为符合大批量的实际生产。虽然该鉴定方法不影响内地的农业生产，但鉴定时间较长，对于种子的经营特别是种子的出口贸易是一道不可逾越的障碍，尤其是我国加入WTO以后，这道障碍越来越明显。受季节、环境等条件的影响，试验有误差（如光、温敏两系不育系），占用资源土地和生产技术人员，一旦试验失败，不容易重新布置试验，但是不可否认的是，该鉴定方法适合大批量的实际生产。

1.4 计算机模拟形态分析技术

在常规鉴定技术的基础上利用计算机的优势进行有限的模拟分析，在鉴定方法上并没有根本改进，因而鉴定效果并不理想。

由于形态学方法难以辨别种子形状差异和形态不太明细的真假品种，且鉴定周期长，在一定程度上受鉴定人员的自身技术与经验制约。因此，通过专业的实验室内检测方法来代替形态学鉴定已成为杂交水稻种子鉴定技术发展的必然方向[5]。

2 生化鉴定法

蛋白质是基因表达的产物，也是测定基因组一致性的依据。生化鉴定法的原理是依据不同品种之间所遗传的物质不相同，则形成不一样的RNA，最终产生不一样的蛋白质或者同工酶。因此，生化鉴定法是在特定的环境下，利用电泳中的谱带多样性，对不同品种（系）的遗传特性进行纯度与真实性鉴定，具有不受外部环境影响、较为方便、鉴定准确性高等优点。此法主要包括同工酶电泳鉴定和蛋白质电泳鉴定。

2.1 同工酶电泳鉴定

同工酶电泳技术于20 世纪60 年代初就初步应用于品种鉴定的研究。朱英国等对国内166 个水稻品种在苗期进行酯酶同工酶检测，获得11 种酶谱类型[6]。武汉大学遗传研究所与北京种子公司协作，用水稻的幼苗为材料，并利用杂种F1和三系亲本的酯酶同工酶图谱的差异来鉴定不同的水稻品种和品系[7]；颜启传也利用该技术检测了杂交水稻及其三系亲本的真实性和品种纯度，通过检测分析证实该鉴定法的检测结果较准确，提高了鉴定分辨率[8]。因此，20 世纪70 年代已推广同工酶电泳法用于品种鉴定，在生产上有着一定的应用价值和意义。

同工酶鉴定法对种子或幼苗的生长质量要求较高，酶的提取和电泳技术的实验条件也要求严格，同工酶表达的特异性又影响着其在不同组织的分布与活性，一旦种子或幼苗出现长势不太好，产生酶的活性低，就会直接导致酶带模糊不清，影响鉴定结果，可利用的同工酶非常有限。

2.2 蛋白质电泳鉴定

种子中蛋白质的种类及含量相对比较稳定，可以用作品种鉴定的依据。不同品种遗传基础物质的DNA不同，形成的模板RNA 也有差异，使其合成的蛋白质表现出差异，依据品种之间在蛋白质的差异，利用电泳技术对品种的蛋白质进行分离检查，制成电泳图谱，通过观察不同品种电泳图谱的不同来加以区别。蛋白质电泳作为鉴定品种的一种方法，应用于杂交水稻品种鉴定方面的报道不多，陆作楣等提取62份杂交水稻三系亲本和杂种一代种子胚乳贮藏蛋白中总蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白样品，采用SDS-PAGE 电泳法分析，根据谷蛋白谱带特征的差异进行品种鉴定[9]。

蛋白质电泳鉴定法快速可靠，不受外部环境制约。但所用的提取液和电泳系统不同，萌芽的种子、幼芽或幼苗及成熟期各个时期表达不稳定，影响着电泳图谱的分离，鉴定结果与操作过程也相关，如实验材料的采集、电泳系统的条件、提取的蛋白液、胶浓度等不同，结果也会不同，导致难以形成统一标准[10-11]。此外，对于遗传相近的品种之间，贮藏蛋白的标记多态性不太丰富，难以找到特异蛋白，在实践中未得到推广应用。

3 DNA分子技术鉴定法

随着DNA 分子技术鉴定应用于植物新品种鉴定大量研究的陆续开展，为杂交水稻品种鉴定提供了新的思路。DNA 分子标记技术以其多态性高、遗传稳定性强，在基因组中频繁出现，易获得、易操作、重复性好等特点被研究者广泛关注和应用。研究表明，DNA分子标记可应用于杂交水稻品种纯度与真实性鉴定，审定监管等各环节，其具备鉴定快速、周期短、准确及简便、经济等诸多优点[12-16]，是农作物品种鉴定的发展方向。

DNA 分子技术鉴定不受生物体各组织、各发育阶段、环境与季节的限制和人为因素的影响，同时，可以弥补和克服形态鉴定与生化鉴定的不足。目前，在杂交水稻分类中广为应用的DNA 分子技术鉴定主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR、SNP。

3.1 RAPD标记鉴定

RAPD 是William JGK 等 和Welsh J 等 于1990 年 创建的一种分子标记，在PCR 基础之上的一种可对整个序列的基因组进行分析的分子技术。利用随机引物对基因组DNA 进行扩增得到多带，而对某个特定的基因型来讲，这些扩增的片段或片段的类型是唯一的，因此，可以用来鉴定品种。1996 年，钱前等利用RAPD标记，成功实现对真、假“II 优63”种子的鉴定[17]。相比RFLP，RAPD 操作较简单，所需的DNA 量小，多态性强、操作简便，成本较低。

在建设项目电气电动轴电气设备安装过程中，有关人员必须按照有关规定进行施工，并在预防的基础上全面控制安装质量，以控制安装质量。确保建设项目的正常使用，充分发挥功能，提高人民生活水平和生活质量。

随着杂交水稻品种的丰富性及交易市场的活跃性，只用单个多态标记鉴定种子的做法，不能满足特定品种大量筛选引物的需求，RAPD 标记鉴定对引物的选择和实验的条件要求较严，因此，该技术在品种鉴定中有一定的局限性。

3.2 RFLP标记鉴定

RFLP 即限制性片段长度多态性标记，是根据不同品种间不同基因组的限制性内切酶位点的碱基发生变化，或者是酶切位点间发生了碱基的缺失与插入，酶切位点的片段发生了变化，造成差异，这种差异可以通过特定的探针进行杂交检测，根据探针位于染色体的不同位点可以作为一种分子标记，构建分子图谱，根据图谱的特异性，从而鉴别真假种子[18]。RFLP标记可用于形态标记、同工酶标记和蛋白质电泳技术难以区别的品种的鉴定。

RFLP 是较早使用DNA 分子标记的应用，检查结果比较稳定，该技术已在小麦、玉米、黄瓜、辣椒、大白菜和甘蓝等作物上得到初步应用。但RFLP 对DNA 的质量要求较高，检测技术繁琐，不适合杂交育种和品种鉴定的大规模应用。

3.3 AFLP标记鉴定

AFLP 标记是以结合RFLP 标记和PCR 技术为基础建立起来的，通过DNA 制备、扩增酶切片段、凝胶及电泳四个基本步骤，对品种进行鉴定。陈一华等最少利用3 对AFLP 引物组合就可以区分l5 个杂交水稻品种，根据品种间DNA 多态性条带的有无，转换成1 和0 指纹数据，从而实现了计算机辅助种子鉴定[19]。美国先锋公司培育的一个优良玉米杂交种的亲本（申请专利）被一个小公司偷用制种，获得了很大利润。先锋公司发现了该公司的侵权行为后，提出诉讼，但因证据不充分一直未能得到解决，最后，先锋公司用AFLP 技术获得DNA 指纹证据后赢得了诉讼，那个小种子公司因被罚巨额赔款而倒闭。

AFLP 多态性水平相当高，且稳定可靠，但需DNA模板量大，需酶切，对DNA纯度要求高，如基因组的酶切不完全，会影响鉴定结果。同时，操作程序长，步骤繁琐，电泳技术较复杂，成本太高，并要求较高的试验技能和高精度的仪器设备[20-21]，同时，它还是专利技术，难以在杂交水稻品种鉴定中普及使用。

3.4 SSR标记鉴定

目前在杂交水稻品种鉴定中，利用分子标记检测技术最多的就是SSR 分子标记鉴定，与RAPD、RFLP、AFLP 分子标记鉴定法相比，SSR 分子标记鉴定结果更容易观察分析，且对差异不太明显的品种也能鉴定区分。

SSR 标记法是发展起来的一种以特异引物PCR 为基础的分子标记技术，具有实验稳定、多态性高、实验程序简单等优点，SSR 标记法已被广泛用于农作物类品种鉴定。SSR 标记法主要包括DNA 提取、PCR 扩增、凝胶电泳、成像观察四个基本步骤，检测程序相对简单，一份样品从取样、检测及读取结果可在几小时内完成，且不受外部环境与季节的影响。

SSR 标记两端的序列多是相对保守的单拷贝序列[22-23]。不同品种间微卫星基序重复次数的不同而形成了多态性，这种多态性可以通过PCR 扩增检测出来，即为简单序列长度多态性[24]。优化PCR 扩增程序主要是在保证取得较好扩增效果的前提下，缩短反应时间，提高工作效率。詹庆才利用SSR 标记鉴定杂交水稻种子纯度时，改变PCR 扩增程序，将变性和退火时间改为15 s，延伸时间改为30 s，扩增35 个循环，缩短PCR反应时间，得到了理想的扩增结果[25]。

SSR 标记法的DNA 提取和纯化是杂交水稻品种鉴定重要而基础的操作步骤。刘之熙等分别采用CTAB方法和简单方法提取“两优培九”幼苗的DNA，均以RM234 为引物进行PCR 扩增，结果表明简单方法提取的DNA 不会影响准确性和分辨率，且简单方法缩短了提取时间，降低成本，极大地提高了工作效率；同时，对传统CTAB和PCR程序进行了改善，利用4%的琼脂糖凝胶进行电泳[26]。

随着杂交水稻新品种组合的培育与栽培，SSR 引物的特异性可能会逐步退化，甚至丧失，已有的SSR引物可能满足不了新品种鉴定要求，因此，需不断创建新的SSR 标记。马红勃等利用12 个SSR 标记构建了42 份杂交稻(其中有24 份材料为杂交稻品种，另外18份材料为杂交稻亲本)的DNA 指纹图谱，并对于遗传多样性进行统计分析[27]。通过聚类将这42个品种分成六大类群，较好地反映了品种之间的亲缘关系，也为杂交亲本的选择提供了一定的参考。同时，所构建的指纹图谱也为杂交水稻品种鉴定提供了科学依据。肖子发等通过实验选用了48 对SSR 引物，多于国内一些专业检测机构或科研单位采用的12 对或24 对引物[28]；通过实验，利用筛选的48 对SSR 引物完成了湖南省审定的77 个杂交稻品种的DNA 指纹图谱构建，成功建立了品种指纹图谱数据库，可有效进行杂交水稻品种鉴定。

根据国家水稻品种鉴定DNA 指纹方法推荐的24对SSR 引物，任辉对8 个杂交水稻品种进行SSR 分子标记鉴定，优化DNA 提取方法和PCR 扩增反应体系，并将SSR 分子标记鉴定结果与分别在5 个不同省份的制种基地田间鉴定结果进行比较，统计分析发现：SSR 分子标记鉴定结果与田间检验结果无显著差异，但SSR 分子标记鉴定结果更容易区分异（杂）种子，而田间鉴定结果难以区分相似的异（杂）株[29]。因此认为，采用SSR 分子标记鉴定方法能够更快速、更准确地鉴定杂交稻品种。

2014 年6 月1 日，农业部出台了新的农业行业标准（NY/T1433-2014）《水稻品种鉴定技术规程 SSR标记法》，当日正式实施，推荐引物增加48对，其中，保留了原来的19 对引物，新增29 对引物。曾晓珊等为确保研究结果与国家标准的一致性，采用国家规定的水稻品种真实性鉴定方法中要求的48对引物，对27个亲本进行了DNA 指纹分析，依次对27 个水稻亲本材料基因组DNA（按顺序排列）进行PCR 扩增，经显影、拍照，得到一套SSR 引物的图谱[30]，根据所构建的指纹图谱，可对某一品种的真实性进行鉴定。

综上所述，通过SSR 分子标记鉴定杂交水稻品种，其检测技术已成熟。但随着每年不断出现新的品种，SSR 引物的特异性可能丧失，因此，还需不断优化和更新SSR分子标记鉴定体系。

3.5 SNP标记鉴定

SNP 指在基因组上单个核苷酸的变异所形成的核酸序列多态性，是目前认为最具有研发潜力的检测技术，与SSR 标记相比具有以下优势：1）遗传稳定性更高；2）高效检测、通量高，每次可检测多个样品，甚至上千个，实现数据统计分析自动化，共享发展数据平台，间接降低了检验检测成本；3）检测快速，检测位点数可达几百万个；4）部分标记与功能基因甚至植物表型相关。

美国康奈尔大学McCouch 实验室率先在Affymetrix公司定制了含有4.4 万个SNP 标记的SNP 芯片，国内研究者对几千份国内外水稻品种的基因序列进行了重新测序，这些研究表明，通过SNP 芯片构建水稻品种DNA指纹是切实可行的[31]。

王钰等通过一种基于PCR 的水稻SNP 标记检测方法结果得出，开发的SNP 标记有助于分析水稻品种的遗传差异[32]，也为建立水稻SSR/SNP 指纹数据库，实现水稻种子信息比对、追溯、防伪、统计、监管和服务等功能奠定了基础。

2021 年6 月20 日，全国农技中心在北京组织召开农业行业标准审定会，《水稻品种真实性鉴定SNP 标记法》《玉米品种真实性鉴SNP标记法》《小麦品种真实性鉴定 SNP 标记法》3 项标准通过审定。标志着SNP 标记法在生物检测领域有着广阔的发展前景，为维护农作物品种创新、市场流通秩序等提供了强有力的技术支撑及依据。

尽管SNP 成本高、一般实验室无法完成检测分析工作，但SNP 这项检测技术具有准确性高的特点，能够有效避免形态学和环境因素的干扰，从而极大地缩短育种进程。因此，构建全国统一标准的品种高密度SNP 指纹十分必要，今后有望以加强SNP 分型检测仪等实验室应用平台为载体，融合种植鉴定，实验室分子鉴定及分子育种协同发展，开启杂交水稻品种鉴定的新篇章。