张得芳，于 倩，史文君

（青海大学农林科学院，西宁 810016）

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是在PCR反应体系中加入荧光集团（带有荧光标记的特异性探针等），并利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，再通过标准曲线对DNA模板进行定量分析的方法，常用于检测基因表达谱、基因表达量分析、转录组结果验证分析等方面[1]，是一种应用广泛、灵敏度高[2]的分析方法。在qRT-PCR的分析过程中，多种因素如RNA和cDNA的浓度纯度[3]、各阶段的反应条件等都会对分析结果产生影响[4]，选择表达稳定的内参基因可对荧光定量PCR反应进行准确校正，从而减小数据误差[5]，不恰当的内参基因会导致表达谱的偏移从而影响分析结果的准确性[6]，因此选择合适的内参基因对试验结果的准确性至关重要。

内参基因是在基因表达过程中不受温度等外部条件影响且在不同样品中均稳定表达的参照基因[7]，利用这个基因的表达水平可以准确量化初始材料的载量。管家基因在所有细胞中均有表达，且表达水平受环境因素影响较小，因此在进行基因表达水平的研究时常用其作为内参基因进行试验。常见的管家基因有：肌动蛋白基因（ACT/Actin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）、转录延伸因子基因（EF1α）、多聚泛素酶基因（UBI/UBQ）、18S核糖体RNA（18S）、β2-微球蛋白基因（B2M）和亲环蛋白基因（CYP）等[8]。现有的研究表明，在所有组织、发育时期、生理条件下均稳定表达的理想内参基因并不存在，所以其表达的稳定性是相对的，需要研究者根据自己的样品类型及试验条件来选择合适的内参基因。由于时空的变化，RNA的表达水平并不恒定的，细胞周期的不同阶段内以及不同类型的细胞或组织都可能存在差异，因此需要根据实际研究的细胞和组织类型以及实验要求，从多种内参基因中筛选出适合自己试验的稳定表达的内参基因，同时也可以选择多内参基因的研究方法，设置两个或两个以上的内参基因，取均值后校正目的基因，从而得到更可靠的结果。常见的内参基因在不同植物[9]、不同处理的样本中表达并不稳定，盲目选择不适宜的内参基因往往会导致结果分析的偏离甚至得到错误结论[10]，所以研究特定植物表达模式前进行其内参基因筛选是很有必要的。正确选择内参基因，很大程度上依赖于所研究的细胞或组织及试验条件，不同的试验需要寻找适合试验体系的内参基因[11]。现已筛选出在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[12]、茄子（Solanum melongema）、马铃薯（Solanum tuberosum）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、苹果（Malus pumila）、棉花（Gossypium hirsutum）、甘蔗（Saccharum officinarum）、银杏（Ginkgo biloba）、杉木（Cunninghamia lanceolata）等植物中在特定条件或组织部位中稳定表达的内参基因，用于植物基因表达谱表达分析、转录组数据分析和胁迫下作用机制等方面的研究。

宁夏枸杞（Lycium barbarum）和黑果枸杞（Lycium ruthenicum）均为茄科枸杞属灌木，耐盐碱、干旱、荒漠，常在绿化造林中用作水土保持的树种，在我国西北等地体现出较高的生态价值，也是中国特有的药食同源类植物[13]，具有较高的研究价值和应用前景。目前枸杞的研究大部分主要集中在育种栽培、化学成分分析、药理学与临床应用、食品及食品保健品开发等方面，对于枸杞耐盐性的相关报道大多是生理生化变化等内容，关于离子吸收转运的调控机制及相关基因的功能研究方面涉及比较少，有待于进行更多、更全面地研究来填补空缺，因此对于枸杞抗盐碱的研究具有重要的意义。

本研究在枸杞以及其他茄科植物如番茄、马铃薯、茄子等植物中挑选出GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S这5个常用基因为候选内参基因，以不同浓度NaCl处理后的宁夏枸杞、黑果枸杞组培苗的叶片部分为试验材料，对5个候选内参基因进行荧光定量PCR等试验，通过反应循环阈值（Ct）、变异系数等指标分析评估表达最稳定的基因，并利用GeNorm、Normfinder和BestKeeper软件进行稳定性分析，进而筛选出最适合宁夏枸杞、黑果枸杞荧光定量PCR的内参基因，为后续通过qRT-PCR分析枸杞基因表达趋势等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

试验材料选用长势良好的宁夏枸杞和黑果枸杞组培幼苗，将根部培养基洗净后移至装有清水的培养瓶中，并对枸杞幼苗进行0（CK），100，200，300，400mmol·L-1NaCl溶液处理培养，每个浓度均设置3次重复，每瓶培养瓶内放5~8株幼苗，处理7d后分别采样编号，用液氮速冻后，放置于-80℃超低温冰箱中备用。

1.2 枸杞总RNA的提取与检测

称取400mg不同浓度盐胁迫后的冷冻枸杞叶片，在液氮中充分研磨，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Ex‐traction Kit试剂盒提取枸杞叶片部分的总RNA，通过Nanodrop OneC超微量分光光度计对提取的RNA进行浓度和纯度（OD值）的测定和检验，筛选出浓度大于100ng·μL-1且A260/280在1.90~2.20的RNA样品，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性对其浓度纯度进行验证。

1.3 cDNA合成

使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒将总RNA反转录合成为cDNA。反应使用10μL体系：5x PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL、Total RNA模板 根据浓度计算（最多500ng）、RNase Freed dH2O补充到10μL。反应条件为：37℃15min（反转录反应）、85℃5s（反转录酶的失活反应）。将反转录后的cDNA放置于-20℃冰箱中，用于后续的PCR验证以及qRT-PCR的反应。

1.4 引物设计

根据枸杞的其他现有研究中筛选出5个枸杞、番茄、马铃薯等茄科植物常用的内参基因GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S为候选内参基因（表1），通过NCBI等数据平台或已有文献中检索获得候选内参基因的序列信息，使用Primer5.0软件设计引物，长度20~25bp，CG%为45%~55%，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，在进行试验前将上下游引物均稀释到工作浓度。

表1 候选内参基因的qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers of candidate internal reference genes

1.5 普通PCR和qRT-PCR

先通过普通PCR验证引物的特异性，反应体系为25μL，其中包括：模板（第一链cDNA）1μL、Premix Taq（Ex TaqVersion 2.0 plus dye）12.5μL、上游引物（20μM）0.5μL、下游引物（20μM）0.5μL、灭菌水10.5μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min、共35个循环、72℃后延伸5min，再通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行特异性验证。

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒进行qRT-PCR试验，反应在BIO-RAD CFX Connect Real-Time Systern（伯乐生命医学产品有限公司，上海）qRT-PCR仪上进行。反应以2μL枸杞第一链cDNA为模板，加入TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5μL、PCR Forward Primer（10μM）1μL、PCR Reverse Primer（10μM）1μL、灭菌水8.5μL，体系共25μL。反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共50个循环，溶解曲线65~95℃，增加0.5℃用时0.05s。

1.6 数据分析

利用Microsoft Excel 2010对qRT-PCR结果中的周期阈值（Ct）进行统计分析，分析候选内参基因的稳定性，并用OriginPro 9.1软件对结果进行统计图的绘制，评估其是否适宜用作荧光定量PCR反应的内参基因。

使用RefFinder平台基于GeNorm、Normfinder和BestKeeper软件算法对5个候选基因的试验结果进行计算验证，综合各方法得到适用于本研究后续试验中最为准确、合适的内参基因。

2 结果与分析

2.1 枸杞RNA的检测与引物特异性验证

先使用超微量分光光度计对提取的RNA进行浓度和纯度的检测，得到的浓度值均高于100ng·μL-1，OD值（A260/280）在2.00~2.20；通过1%的琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA进行检测，结果如图1，双条带型（18s、28s）清晰无拖带，完整度较好，表明提取的枸杞RNA浓度和纯度都达到试验要求，可用于下一步研究。

由图2可知，以所有候选内参基因的cDNA为模板进行普通PCR扩增，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测可知，扩增结果均可得到清晰、单一的特异性条带，明亮无杂带，表明扩增产物无引物二聚体和非特异性扩增，可用于后续的qRT-PCR试验。

2.2 盐胁迫条件下枸杞内参基因的qRT-PCR分析

以枸杞cDNA为模板，根据设计的引物进行荧光定量PCR分析，根据5个候选内参基因的熔解曲线导数图谱（图3）可知，在不同浓度的NaCl溶液（0，100，200，300，400mmol·L-1）处理下，熔解曲线导数图谱中均只出现单一主峰，前后无其他杂峰；由扩增曲线（图4）可知，扩增曲线为S型，无其他异常波动，表明荧光定量PCR中引物特异性较好，其中，GAPDH、Actin、EF1α基因的曲线更集中、重复性高，其引物特异性表现优于UBI、18S基因。

M.D2000；1-5.0，100，200，300，400mmol·L-1 NaCl Lycium barbarum；6-10.0，100，200，300，400mmol·L-1 NaCl Lycium ruthenicum

M.D2000；1.GAPDH；2.Actin；3.EF1α；4.UBI；5.18S

图3 qRT-PCR的熔解曲线导数图谱Figure 3 The melting curve derivative map of qRT-PCR

图4 qRT-PCR的扩增曲线图谱Figure 4 The amplification curve map of qRT-PCR

5个候选内参基因在经不同浓度NaCl处理后的宁夏枸杞与黑果枸杞中的荧光定量PCR结果如图5。循环阈值（Ct）是选择内参基因的重要标准，通过Ct值的变化趋势判断基因的表达量稳定情况。由图5可知，5个候选内参基因的Ct值均值大部分集中在18~25之间，其表达水平存在差异。其中，EF1α、UBI、18S基因的反应Ct值变化幅度很大，稳定性不高：EF1α基因的表达情况随着盐胁迫浓度的升高呈先下降后上升再下降的情况，且在宁夏枸杞中最高浓度下有所回升；UBI基因的变化趋势在宁夏枸杞和黑果枸杞中都为明显的持续下调；18S基因的变化趋势为先下降后上升再下降，在黑果枸杞中400mmol·L-1NaCl处理下变化趋势又有所上升。综上，这3个基因均不宜作为内参基因用于荧光定量PCR的试验，且与上述3个基因相比，GAPDH、Actin基因的稳定性较好，其中Actin基因的Ct值变化最小，更适合作为内参基因进行后续试验。

图5 5个候选内参基因的Ct值变化Figure 5 Changes in Ct values of five candidate internal reference genes

2.3 盐胁迫条件下枸杞内参基因的表达稳定性分析

2.3.1 GeNorm软件分析将不同候选内参基因的表达稳定值由高到低进行排序，表达稳定值越低代表基因的稳定性越好，反之越差，程序默认低于1.5的稳定值是内参基因稳定表达的数值范围。由表2可知，宁夏枸杞和黑果枸杞中，排名前两位的内参基因为Actin和GAPDH，其表达稳定值分别为1.142和0.560，小于1.5的预定范围，稳定性较好，表明这两个基因适合作为内参基因用于宁夏枸杞和黑果枸杞的qRT-PCR试验中，而EF1α、UBI和18S基因的表达稳定值均大于1.5，这些基因在枸杞中表达的稳定性较差,不适合作为内参基因用于后续反应。

表2 GeNorm软件分析5个候选内参基因在不同条件下的表达稳定性Table 2 GeNorm analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.2 NormFinder软件软件得出的数据中表达稳定值与基因稳定性呈负相关，即数值越小，基因的表达越稳定。由表3可知，宁夏枸杞中，候选内参基因的表达稳定值由低到高依次为UBI、Actin、GAPDH、EF1α和18S，黑果枸杞中由低到高排序依次为Actin、GAPDH、EF1α、18S、UBI，Actin基因的表达稳定值最小，即稳定性最好。

表3 NormFinder软件分析5个候选内参基因在不同条件下的表达稳定性Table 3 NormFinder analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.3 BestKeeper软件通过qRT-PCR反应得出的Ct值判断内参基因表达的稳定程度，标准差（SD）和变异系数（CV）越低的基因表达的稳定性越好。由表4可知，5个候选内参基因中，GAPDH、EF1α、UBI、18S基因在宁夏枸杞和黑果枸杞中的标准差大于1，即这些基因的表达在本试验中盐胁迫条件下不稳定，不宜作为盐胁迫试验中用作后续荧光定量PCR试验的内参基因使用。综合两种枸杞中基因的表达情况，Actin基因的标准差均小于1，表达的稳定性最高。

表4 BestKeeper软件分析5个候选内参基因在不同条件下的表达稳定性Table 4 BestKeeper analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.4 综合分析由表5可知，本试验以经过不同浓度NaCl胁迫后的宁夏枸杞和黑果枸杞幼苗的叶片部分为材料，根据不同软件算法综合排名以及qRT-PCR结果筛选出的最适合进行宁夏枸杞与黑果枸杞实时荧光定量分析试验的内参基因为Actin基因，EF1α、UBI和18S基因的表达稳定性较差,不适合用作内参基因。

表5 5个候选内参基因在不同条件下表达稳定性的综合分析Table 5 Comprehensive analysis of expression stability of five candidate reference genes under different conditions

3 讨论与结论

实时荧光定量PCR因其灵敏度、特异性、准确性、范围广等优点广泛应用于mRNA定量分析、基因表达谱等多方面研究中，其试验结果的准确性主要依托于根据不同类型的植物样本以及反应进行的条件选择合适的内参基因。在qRT-PCR中，内参基因的稳定性非常重要，直接影响着试验结果的准确性。研究发现在应用qRT-PCR技术进行表达分析时，选择多个内参基因作为校正标准，更有利于研究的准确进行。GeNorm、Norm‐Finder和BestKeeper程序在对参考基因的打分排名中会产生轻微的差异[14]，这可以由统计算法的差异来解释[11]。本研究使用了3种不同的统计算法，结合荧光定量反应中各基因的表现，尽量减少参考基因稳定性评估中可能出现的偏差。

GAPDH基因是光合作用固氮循环、糖降解、糖异生等反应的关键因子，是最常用的内参基因之一，因其同源性较低，较为独特[15]。CRYSTIAN等[16]对甘蔗在不同胁迫条件下稳定表达的内参基因进行筛选得出，GAPDH基因在所有软件中表现最稳定，表明其适用于甘蔗干旱胁迫的基因表达研究；WANG等[17]对不同组织部位和盐碱、干旱胁迫下的棉花内参基因进行筛选发现，GAPDH和UBQ7基因均可作为内参基因用于根、叶片的盐碱以及干旱条件下荧光定量分析中，适用范围较广。但也有研究表明GAPDH基因在某些特定条件下其表达存在不稳定性，LØVDAL等[18]对不同非生物胁迫下番茄内参基因筛选结果表明，GAPDH和PGK基因在光胁迫期条件下排名最高，但在氮元素和寒冷胁迫期时排名不佳。

Actin基因是一类高度保守的球状微丝结构蛋白，可分为α、β、γ 3种，β-Actin基因在不同组织中的表达量最高、变化量最小[19]，也作为内参基因广为使用。苏西娅等[20]对银杏雌雄株不同组织部位的最适内参基因进行研究发现，不同候选基因的稳定性有所不同，GbUBQ在不同发育时期的雄株叶片中表达最稳定，GbACT在雌株叶片表达最稳定。EF1α是细胞内含量仅次于肌动蛋白的蛋白质因子，其基因在根和叶片中稳定高度保守性表达[21]。NICOT等[22]使用GeNorm软件对马铃薯进行了寒冷、盐碱等非生物胁迫，结果表明EF1α表现最稳定；樊连梅等[23]对苹果果实着色期的qRT-PCR理想内参基因进行筛选，结果表明EF-1α的表达水平高且最稳定；但DA CRUZSARAIVA等[24]在大豆的研究中发现，该基因在不同的发育时期和不同条件的胁迫下表达量会有不同程度的变化，其稳定性表现不佳。

UBI/UBQ基因是泛素家族基因，主要作用于蛋白质的降解过程[25]，该基因在同一物种的不同品系之间以及不同的软件之间的计算结果都会显示出基因表达的差异，但是在紫花苜蓿（Medicago lupulina）的研究中发现，该基因的表达在不同浓度的锌胁迫下处于比较稳定的状态[26]；AULER等[27]在水稻内参基因的研究中发现UBQ5基因可作为内参基因用于所有样品和软件的评估，在基因表达时稳定性表现较好。

18S基因主要在维持细胞内基础代谢等途径发挥作用[28]，是真核生物细胞中最保守的基因之一[29]。MIKA‐MI等[30]在对红毛菜属植物的研究中发现，在营养缺乏、盐胁迫和温度胁迫条件下，18S基因的表达也会出现随着胁迫时间和浓度的变化而变化的现象。这些基因因其特定的表达特点常被用作内参基因进行荧光定量PCR分析。

研究表明，在不同处理、不同植物组织中，最适合的内参基因存在差异。盐碱环境等非生物胁迫会影响到植物中的看家基因的表达量。例如，GALLI等[31]在草莓（Fragaria ananassa）的盐胁迫发现GAPDH基因的表达水平随着盐碱的浓度而改变；ZHANG等[32]对罂粟（Papaver somniferum）中的研究表明，不同的胁迫处理也影响着看家基因的表达量；CHEN等[33]对狗牙根（Cynodon dactylon）的8个参考基因在不同非生物条件胁迫下的基因表达进行研究得出，在盐、干旱、冷和热胁迫下在叶和根中不同的基因表现出差异表达稳定性，PP2A和CACS的表达水平在盐胁迫下的根和叶中、干旱胁迫下的叶中以及冷热胁迫下的根中的表达水平稳定，EF1α和TIP41在干旱胁迫植物的根中表达稳定，UPL7、TUB和GAPDH在冷胁迫下在叶片中稳定表达，PP2A和TIP41在热胁迫下的叶片中是稳定的。因此，针对不同处理、不同组织部位的植物样品，在进行不同的qRT-PCR反应时应选择与之对应的内参基因，不应一概而论，这也在一定程度上表明了进行表达分析时筛选合适内参基因的重要性。

本研究从5个候选基因中筛选出Actin基因的表达的稳定性最高，其表达并没有受到不同胁迫处理的影响，是最适合宁夏枸杞、黑果枸杞qRT-PCR反应进行的内参基因，保证了后续试验结果的可靠性，也为后续对相关基因的表达模式分析以及在盐胁迫条件下的抗逆机制等方面的研究提供理论指导。