郭菲菲 综述 崔久嵬 审校

自2017 年至今，以Kymriah（CTL019）和Yescarta（KTE-C19）为代表的系列嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治疗相继被批准上市，CAR-T 疗法在血液肿瘤治疗中取得突破性进展[1]。然而，当研究进一步将注意力转向占据全部肿瘤90%比例的实体瘤时，CAR-T 疗法并未得到令人满意的结果，实体瘤本身及其微环境的特殊性为CAR-T 细胞治疗带来了巨大挑战。一方面，实体瘤细胞抗原的异质性以及特异性肿瘤抗原（tumor-specific antigen，TSA）的缺乏使CAR-T 难以对肿瘤细胞进行精准的靶向性识别和杀伤[2]；另一方面，实体瘤特殊的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），包括异常血管结构和基质成分组成的第一道物理屏障，以及TME 中多种免疫抑制细胞、抑制性免疫及代谢分子组成的二次屏障，使CAR-T 难以浸润肿瘤组织，同时面临活性衰竭及功能失调的风险[3]。针对这些问题，基于CAR-T 自身改造以及CAR-T 联合治疗两个方向的研究取得了较好的结果。本文对CAR-T 治疗实体瘤最新的研究进展进行综述以供参考。

1 CAR-T 治疗实体瘤的优化靶点选择

仅表达于肿瘤细胞的TSA 是抗肿瘤治疗的理想靶点，然而，由于TSA 极其缺乏且大部分存在于细胞内，靶点选择投向同时表达于肿瘤细胞（高表达）和正常组织（低表达）的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，面临潜在的脱靶效应(on-target/off-tumor)[4]。据报道，1 例伴有肝肺转移的晚期结肠癌患者，在接受抗HER2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2) CAR-T 治疗5 天后发生死亡。CART 对表达低水平HER2 肺上皮细胞的攻击所导致的血液高水平细胞因子状态被认为是主要的致死原因[5]。实体瘤细胞的抗原异质性是限制靶点选择的又一关键因素，单靶点CAR-T 难以根除同一肿瘤病灶中的所有实体瘤细胞[2]。

1.1 增强CAR-T 的抗原特异性识别

理想的特异性靶点是增强CAR-T 抗原识别的根本方法。表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ）是目前研究较为广泛的靶点之一，由EGFR 的第一和第八外显子在一个新甘氨酸的连接作用下融合而成。因其具有高度肿瘤组织特异性，临床前研究将其作为CAR-T治疗靶点，并取得了较好的效果[6]。更有临床试验进一步肯定了EGFRvⅢ作为CAR-T 临床治疗靶点的可行性。由O'Rourke 等[7]开展的一项针对9 例复发性胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）患者的I 期临床研究结果显示，EGFRvⅢ CAR-T 治疗具有良好抗肿瘤效果、安全性（无脱靶毒性）及耐受性。由溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）介导的肿瘤细胞抗原递送与标记是提供CAR-T 特异性靶点的另一有效途径。典型的是编码截短CD19 蛋白（truncated CD19，CD19t）的溶瘤病毒抗原递送标记系统。Park 等[8]利用编码CD19t 的溶瘤牛痘病毒（OV19t）感染多种实体瘤细胞，均显著促进了CAR-T 细胞浸润及肿瘤杀伤。同时，CAR-T 介导的肿瘤裂解进一步导致OV19t 释放，促进了CD19t 在实体瘤细胞上的表达，形成肿瘤清除的正反馈。

通过区分肿瘤组织与正常组织TAA 密度的不同，也能够增加CAR-T 抗原识别的特异性和敏感性。Hernandez-Lopez 等[9]利用synNotch（synthetic Notch）受体系统构建了一种超灵敏抗原密度感应性CAR-T，即由一个针对HER2 的低亲和力synNotch 受体控制一个针对HER2 的高亲和力CAR 的表达。当syn-Notch 受体被高抗原密度HER2 完全激活时，则会诱导高亲和力CAR 的表达，随后启动CAR-T 对肿瘤细胞的特异性杀伤。经体外及体内研究证实，表达这一系统的CAR-T 细胞对表达正常数量HER2 的非肿瘤细胞和表达100 倍HER2 的肿瘤细胞的杀伤具有显著性差异。另外，多种传统表观遗传调节剂对抗原密度的调节也被证实能够增加CAR-T 抗原识别的敏感性。如地西他滨，作为一种DNA 甲基化转移酶抑制剂，被发现可以通过DNA 去甲基化上调胰腺癌细胞上抗原MUC1 的表达，增加MUC1 CAR-T 的特异性识别和杀伤[10]。

1.2 克服肿瘤细胞抗原异质性

对于实体瘤的高度异质性，同时靶向两种或两种以上肿瘤抗原是一种有效的解决办法，可以通过构建包含不同scFv（single-chain variable fragment）结构的CAR-T 及CAR-T 联合双特异性抗体来实现，从而有效清除表达任一靶点抗原的肿瘤细胞。目前，双特异性CAR-T 已经得到广泛研究且效果显著。与针对单一抗原的CAR-T 相比，Kloss 等[11]构建的同时靶向前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen，PSMA）和前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen, PSCA）的CAR-T 细胞被证实能够在前列腺癌小鼠模型中实现对表达单靶点和双靶点抗原肿瘤细胞的清除。近期一项研究利用synNotch 受体系统设计了一种“prime-and-kill”逻辑门控回路，从而更好实现了精确的肿瘤控制。在这一回路中，只有当syn-Notch 受体识别特异性的肿瘤启动抗原（如EGFRvⅢ和MOG）后，识别广泛存在的肿瘤杀伤抗原（如EphA2 和IL13Rα2）的CAR 才能启动转录并发挥抗肿瘤作用。在GBM 小鼠模型中，这一新型CAR-T 显示出优于传统CAR-T 的抗肿瘤疗效和持久性，且无脱靶毒性，提供了一种适用于实体瘤的一般识别策略[12]。

CAR-T 与双特异性抗体的联合主要包括双特异性T 细胞衔接器（bi-specific T-cell engager，BiTE）和双特异性适配器（bi-specific adapter）。BiTE 由两种scFv 组成，一种识别T 细胞表面蛋白CD3ε，另一种识别肿瘤细胞表面抗原，从而介导CAR-T 及内源性T细胞对肿瘤细胞的杀伤。Choi 等[13]设计了一种自分泌anti-EGFR BiTE 的anti-EGFRvⅢ CAR-T，证实其在GBM 小鼠模型中根除异质性肿瘤细胞的能力。双特异性适配器由一个标签蛋白（如生物素）和一个针对单个抗原的抗体片段偶联而成，将靶向不同抗原的双特异性适配器组合与靶向标签蛋白的通用型CAR-T联合也能够克服肿瘤异质性。如通过与anti-CD19与CD20 adapters 的联合，anti-biotin CAR-T 被发现能够以抗体剂量依赖的方式实现干扰素释放及异质性肿瘤细胞杀伤[14]。

2 CAR-T 治疗实体瘤克服TME

实体瘤具有极为复杂的微环境，对CAR-T 细胞的浸润、活性及功能有不同程度的抑制。实体瘤微环境中高度异常的血管和基质结构被认为是阻碍CART 细胞浸润的关键因素。与正常组织相比，肿瘤血管常呈不规则形状并伴有不同程度塌陷，而肿瘤基质则更为致密和刚性。两者共同形成的物理屏障导致CAR-T 难以浸润[3]。实体瘤的免疫抑制性微环境主要由免疫抑制细胞如髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）及调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg)，免疫抑制性检查点如PD-L1 以及多种免疫抑制性因子如TGF-β 组成，被认为是影响CAR-T细胞活性及功能的关键因素[15]。肿瘤异常的代谢物累积以及典型的缺氧、低PH、氧化应激等条件构成了损害CAR-T 抗肿瘤作用的代谢微环境。如吲哚胺2,3双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）被发现能够通色氨酸消耗和犬尿氨酸累积来抑制CAR-T 细胞毒性，缺氧环境中的CAR-T 细胞也被发现功能严重受损[16]。

2.1 增强CAR-T 的TME 浸润

多种传统疗法因其对TME 的重塑作用，在促进CAR-T 的肿瘤组织浸润中占有着优势。化疗预处理联合CAR-T 已经被广泛应用于临床研究。一项研究（NCT01869166）提示，在anti-EGFR CAR-T 治疗前给与白蛋白结合型紫杉醇联合环磷酰胺治疗，可通过结合富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）来消耗肿瘤基质，从而促进CAR-T 细胞浸润并提升其抗肿瘤疗效[17]。局部放疗也能够显著增强CAR-T 细胞的肿瘤浸润。如在GBM 小鼠模型中，研究发现在静脉注射anti-GD2CAR-T 后进行局部放疗能够有效促进CAR-T 细胞的血管外渗及肿瘤浸润，并增强其抗肿瘤作用[18]。鉴于热疗对TME 的重塑作用，包括破坏基质及扩张血管结构等，CAR-T 联合光热治疗也能够显著促进CAR-T 累积及肿瘤控制。在激光照射下的实体瘤小鼠模型中，联合应用具有双光热-纳米催化性质的纳米酶被发现能够增强anti-B7-H3 CAR-T 细胞的浸润[19]。

肿瘤抗血管生成治疗和基质降解治疗对CAR-T细胞浸润的促进则更为直接。在原位人神经母细胞瘤的小鼠模型中，Bocca 等[20]证实贝伐单抗治疗能够通过促进肿瘤血管正常化来增强anti-GD2 CAR-T 细胞的大量浸润。肿瘤基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖成分（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）的降解被认为是CAR-T 细胞跨越肿瘤基质屏障的第一步。基于此设计的表达肝素酶的CAR-T（anti-HPSE CAR-T）被证实通过降解HSPG 增强自身浸润[21]。另外，由肿瘤相关基质细胞组成的纤维结构被认为是形成肿瘤基质屏障的主要原因，成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）作为肿瘤相关纤维母细胞的标志成为一个潜在治疗靶点。如anti-FAP CAR-T 被发现在肺癌及胰腺癌小鼠模型中能够有效减少肿瘤基质并抑制肿瘤生长[22]。

2.2 克服肿瘤免疫微环境的抑制

免疫抑制细胞的功能抑制或清除是维持肿瘤浸润CAR-T 细胞功能的有效途径之一。低剂量化疗作为目前临床CAR-T 治疗的主要预处理方法之一，能够通过诱导免疫抑制细胞清除来重塑肿瘤免疫微环境以增强CAR-T 疗效。Guo 等[17]对晚期胆管癌患者的anti-EGFR CAR-T 治疗进行白蛋白结合型紫杉醇和环磷酰胺预处理，显著提高了CAR-T 的治疗效果。另外，越来越多的临床前研究提示，CAR-T 与现存疗法的联合或CAR-T 自身的改造都能够有效清除免疫抑制细胞并增强CAR-T 疗效。Watanabe 等[23]将表达TNF-α 和IL-2 的溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus，OAd）联合CAR-T，发现其能够促进肿瘤相关巨噬细胞向M1 型极化并增加DC 细胞成熟，从而显著提升CAR-T 浸润及抗肿瘤作用。近期一项研究提出，利用CAR-T 细胞递送模式识别受体激动剂RN7SL1（一种激活RIG-I/MDA5 信号通路的内源性RNA），能够显著抑制MDSCs 发育并促进具有共刺激特征DC 细胞亚群的生长，从而促进CAR-T 功能[24]。

免疫检查点是帮助CAR-T 克服实体瘤免疫抑制微环境的另一个选择。CAR-T 联合免疫检查点抑制剂已被广泛证明能够有效增强CAR-T 对实体瘤的控制。近期一项研究显示，临床恶性胸膜间皮瘤患者在接受派姆单抗联合anti-MSLN CAR-T 治疗后，表现出良好安全性及耐受性，患者中位总生存期可达23.9个月[25]。CAR-T 联合编码免疫检查点抗体的OA 也能够有效帮助CAR-T 克服免疫抑制。Tanoue 等[26]设计的编码PD-L1 迷你抗体的OAd 被证实能够在前列腺癌模型中增强anti-HER2 CAR-T 功能。此外，通过对CAR-T 进行改造，包括抑制免疫检查点的表达或阻断其信号传递，也能够有效增强CAR-T 疗效。Zou 等[27]研究发现，同时下调抑制性免疫检查点受体PD-1、Tim-3 和Lag-3 表达的CAR-T 细胞具有更好的抗肿瘤作用。除了通过CRISPR/Cas9技术对PD-1进行敲除，利用腺嘌呤碱基编辑器改变PD-1 的糖基化残基也能够降低PD-1 表达，从而增强CAR-T 细胞毒性[28]。通过对PD-1 的胞外区进行修饰可以阻断其信号传递。如Pan 等[29]通过在anti-GPC3 CAR-T 中引入一个由PD-1 的胞外结构域和IgG4 的CH3 构成的可溶性PD1-CH3 融合蛋白来切断PD-1/PD-L1 信号传递，并证实了其在肝细胞癌小鼠模型中显著的抗肿瘤作用。

2.3 克服肿瘤代谢微环境的抑制

对于实体瘤异常的代谢微环境，通过对CAR-T进行改造或与相关抑制剂联合均能有效提高CAR-T疗效。腺苷是TME 中高度累积的代谢物之一，能够通过激活CAR-T 细胞表面腺苷受体(adenosine 2a receptor，A2aR)来抑制其功能。Masoumi 等[30]研究发现，无论是在CAR-T 结构中同时表达anti-A2aRshRNA序列，还是将CAR-T 联合A2aR 特异性小分子拮抗剂SCH-58 261，均能有效提高CAR-T 功能。腺苷脱氨酶1（adenosine deaminase 1，ADA 1）能够将腺苷分解为肌苷，Qu 等[31]据此设计的过表达ADA 的CART 细胞在卵巢癌及结肠癌小鼠模型中呈现显著扩增，并有效控制肿瘤生长及延长小鼠存活期。IDO 是肿瘤代谢微环境中另一潜在靶点。Huang 等[32]研究证实，miR-153 能够通过靶向IDO1 的3’非编码区抑制其在结肠癌细胞中的表达，在体外及小鼠体内模型中增强CAR-T 的抗肿瘤作用。TME 的氨基酸水平对CAR-T 细胞功能同样影响巨大。如TME 中的低水平精氨酸会损害缺乏精氨酸再合成酶精氨琥珀酸合酶（arginine resynthesis enzymes argininosuccinate synthase，ASS）和鸟氨酸转氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase，OTC）表达的CAR-T 细胞的功能。基于此设计的表达功能性ASS 或OTC 的酶修饰CAR-T 被证实能够有效增加CAR-T 细胞增殖，并在不影响CAR-T 的细胞毒性或衰竭程度的基础上，提高实体瘤清除率[33]。

除了异常的代谢物，缺氧和氧化应激等条件也被利用以解除肿瘤代谢微环境对CAR-T 功能的限制。碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX）是一种参与 缺 氧 诱 导 因 子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF1α）缺氧信号通路的关键蛋白及潜在靶点，Cui 等[34]研究发现，anti-CAIX CAR-T 能够在GBM 小鼠模型中发挥有效抗肿瘤作用。另外，为了应对肿瘤相关的氧化应激，Ligtenberg 等[35]构建了一种过表达过氧化氢酶的CAR-T，其能够高效地将过氧化氢催化成水和氧气并减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）累积，从而维持低氧化状态及具有显著抗肿瘤活性。

3 结语与展望

CAR-T 在实体瘤治疗中虽面临诸多困境，但随着对实体瘤及CAR-T 细胞自身特征认识的不断加深，不断涌现的创新性解决策略为这一疗法带来了新的希望。无论是针对CAR-T 自身结构的优化改造，还是将CAR-T 与其他肿瘤治疗方法相结合，均呈现出良好的应用前景。CAR-T 细胞治疗有望在实体瘤领域血液肿瘤的取得成效，最终使临床肿瘤患者获益最大化。