黄泰来 金 睿 温建崇 谭 华 雷华英 曹满湖*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南今汉药业有限公司，长沙 410300；3.麻阳蓝凤凰农业发展有限公司，怀化 419400)

肉鸡腹部脂肪过量沉积是影响肉品质和商品性状的重要因素，开发具有降脂作用的饲料添加剂对家禽具有重要意义和生产价值。桑树是我国南方种植广泛的一种植物[1]，其提取物含有酚类、黄酮类、生物碱、氨基酸、多糖和甾类化合物等多种生物活性化合物，具有降血糖、降血压、降血脂，抗氧化、抗炎等作用[2-3]。其中，桑叶中黄酮类和其特有生物碱成分1-脱氧野尻霉素(DNJ)被证明在调控糖脂代谢中作用显著。研究表明，DNJ可改善Ⅱ型糖尿病小鼠肝细胞细胞核病变，并将小鼠尿液中16种代谢产物逐渐恢复接近正常水平，有效抑制了葡萄糖苷酶活性、脂肪代谢和氨基酸代谢[4]。Hu等[5]通过大鼠试验以及细胞试验验证，发现桑叶黄酮可通过减少体内外过高的胆固醇积累治疗肝脏类疾病。肉鸡脂肪代谢与脂肪的合成、分解和转运等多个过程有关，其调控机制相对复杂且涉及多条信号通路，其中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路被证明与机体脂质代谢密切相关，但在肉鸡腹脂沉积的研究中较少。此外，关于桑叶提取物对肉鸡腹脂沉积的影响及作用途径的研究也鲜有报道。因此，本研究拟通过在饲粮中添加桑叶提取物，考察其对肉鸡腹脂沉积的影响，并通过其对生长性能、血清和肝脏中脂肪代谢相关指标和基因表达的影响，初步探讨其作用机制，为桑叶提取物在肉鸡生产上的应用提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桑叶提取物由湖南某有限公司提供(批号：MD0.5-200519)，提取方式为水提取，简要步骤如下：桑叶加7.5倍水，提取3次，提取液浓缩，合并浓缩液，醇沉，浓缩挥醇，喷雾干燥，过筛，混合即得。其主要成分及含量如下：多糖5%、总黄酮20%、总酚25%、DNJ 0.5%、总蛋白质30%、粗脂肪2.5%、总灰分15%、水分1.2%、粗纤维0.5%,其他成分0.3%。

爱拨益加(AA)肉仔鸡：由湖南顺成实业有限公司提供。

1.2 试验设计

试验选用1日龄AA肉鸡192只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复8羽。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加400、800和1 200 mg/kg桑叶提取物的饲粮。试验期为56 d，分为1～21日龄(前期)和22～56日龄(后期)2个阶段。基础饲粮参照《肉鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)和NRC(1994)肉鸡营养需要标准配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

续表1项目Items1～21日龄 1 to 21 days of age22～56日龄 22 to 56 days of age鱼粉 Fish meal1.502.28大豆油 Soybean oil2.173.22DL-蛋氨酸 DL-Met0.180.10磷酸氢钙 CaHPO41.381.09石粉 Limestone1.151.21食盐 NaCl0.300.30预混料 Premix1)1.001.00合计 Total100.00100.00营养水平Nutrient levels2)代谢能 ME/(MJ/kg)12.5412.96粗蛋白质 CP21.5019.50赖氨酸 Lys1.171.02蛋氨酸 Met0.530.43钙 Ca1.000.95有效磷 AP0.450.40

1.3 饲养管理

试验期间自由采食和饮水，日常管理参照《商品肉鸡生产技术规程》(GB/T 19664—2005)。

1.4 样品采集

血液样品采集：在21和56日龄，每个重复随机选取1只健康的肉鸡，颈静脉采集血样，用离心机离心分离血清待测。

肝脏样品采集：在21和56日龄，每个重复随机选取1只健康的肉鸡，肝脏样本保存在液氮中，测定时称取肝脏样品0.1 g，用无水乙醇匀浆，3 000 r/min离心15 min，使肝脏与无水乙醇比例为1∶9，取上清用于肝脏生化指标检测；其余肝脏样品于-80 ℃冰箱保存，用于后续基因表达的检测。

1.5 测定指标

1.5.1 生长性能

在1日龄时，称取初始体重。在21和56日龄时，空腹12 h后(停料不停水)，称量统计各重复鸡体重，计算各重复各阶段的耗料量、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.5.2 腹脂沉积

腹脂沉积以腹脂沉积量来表示，计算公式如下：

腹脂沉积量(g/kg)=腹脂重(g)/肉鸡活重(kg)。

1.5.3 血清和肝脏生化指标

使用全自动生化仪(迈瑞BS系列)测定血清和肝脏中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.5.4 肝脏中脂肪代谢相关基因表达

提取肉鸡肝脏组织中总RNA，反转录，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定基因mRNA相对表达量。RNA提取试剂盒(AG21017)、反转录试剂盒(AG11706)、RT-qPCR试剂盒(AG11701)均购自艾科瑞生物工程有限公司。试验操作严格按照试剂盒说明书执行，反应体系为10 μL，于(Roche)LightCycler 2.0荧光定量仪上测定。试验测定肝脏中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇类调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、肉碱棕榈酰转移酶-1α(CPT-1α)、脂酰辅酶A氧化酶(ACO)、脂蛋白分解酶(LPL)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的mRNA相对表达量，相关引物序列见表2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，采用2-△△Ct法定量上述目的基因的mRNA相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR的引物序列

1.6 统计方法

试验数据使用SPSS 20.0软件进行统计分析，采用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 桑叶提取物对肉鸡生长性能的影响

由表3可见，与对照组相比，饲粮中添加桑叶提取物对肉鸡前期、后期和全期的ADFI、ADG和F/G均无显著影响(P>0.05)。

2.2 桑叶提取物对肉鸡腹脂沉积量的影响

由表4可见，与对照组相比，饲粮中添加400、800和1 200 mg/kg桑叶提取物在21、56日龄时均显著降低了肉鸡的腹脂沉积量(P<0.05)，其中56日龄腹脂沉积量的下降比率分别为30.38%、36.32%、44.90%，但3个添加水平间差异不显著(P>0.05)。

2.3 桑叶提取物对肉鸡血清和肝脏生化指标的影响

2.3.1 桑叶提取物对肉鸡血清生化指标的影响

由表5可见，在21和56日龄时，与对照组相比，饲粮中添加不同水平的桑叶提取物对肉鸡血清TG、GLU、HDL-C和LDL-C含量均无显著影响(P>0.05)，添加800 mg/kg桑叶提取物可显著降低21日龄肉鸡血清中TC含量(P<0.05)，添加1 200 mg/kg桑叶提取物可显著降低21和56日龄肉鸡血清中TC含量(P<0.05)。

表3 桑叶提取物对肉鸡生长性能的影响

表4 桑叶提取物对肉鸡腹脂沉积量的影响

2.3.2 桑叶提取物对肉鸡肝脏生化指标的影响

由表6可知，在21和56日龄时，与对照组相比，饲粮中添加不同水平的桑叶提取物对肉鸡肝脏中TG含量无显著影响(P>0.05)，但添加800、1 200 mg/kg桑叶提取物可显著降低肉鸡肝脏中TC的含量(P<0.05)。

表5 桑叶提取物对肉鸡血清生化指标的影响

表6 桑叶提取物对肉鸡肝脏生化指标的影响

2.4 桑叶提取物对肉鸡肝脏脂质代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

由表7可知，与对照组相比，饲粮中添加桑叶提取物均显著增加了肉鸡肝脏中AMPKα的mRNA相对表达量(P<0.05)；添加800、1 200 mg/kg的桑叶提取物显著降低了肝脏中脂肪酸合成中SREBP-1c、ACC和FAS的mRNA相对表达量(P<0.05)；但3个添加组间肝脏中PPARα、CPT1α、ACO、LPL、L-FABP的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。

表7 桑叶提取物对肉鸡肝脏中脂质代谢相关基因表达的影响

3 讨 论

桑叶及其提取物对生长性能的影响与其添加的形式有关，桑叶在动物生产上的应用目前主要有桑叶粉、发酵桑叶和提取物几种。黄静等[6]研究表明，随着添加水平的提高，桑叶粉组和发酵桑叶粉组使胡须鸡的ADG、ADFI逐渐降低。张金龙等[7]的研究表明，饲喂肉鸡2%的发酵桑叶粉可以显著提高肉鸡(罗斯308)ADFI和ADG，但对F/G无显著影响。宋琼莉等[8]在矮脚黄鸡饲粮中添加0.2%、0.5%、0.8%的桑叶提取物，各桑叶提取物组的ADG均显著提高，但均有降低F/G的趋势。本试验结果表明，饲粮中添加桑叶提取物对肉鸡前期、后期和全期的ADFI、ADG和F/G均无显著影响。造成上述研究结果差异的原因可能是桑叶提取物相较桑叶粉，其功能性成分(黄酮、酚类生物碱等)含量更多，而抗营养因子含量较少有关。

本研究发现，桑叶提取物可显著降低AA肉鸡的腹脂沉积量，这与目前桑叶及其提取物在家禽上的其他研究结果类似。李瑞雪等[9]研究发现，添加桑叶粉极显著降低了皖西白鹅的腹脂率。兰翠英等[10]的研究表明，饲粮中添加5%、8%、10%的桑叶粉可降低肉鸡腹脂率，其中5%桑叶粉添加量可降低腹脂率达39.81%。本研究结果证明，400、800和1 200 mg/kg桑叶提取物可降低AA肉鸡的腹脂沉积量分别达30.38%、36.32%、44.90%，这证明桑叶提取物对AA肉鸡腹脂沉积有降低作用。

血清和肮脏中与脂肪代谢相关生化指标的试验结果表明，饲粮中添加800、1 200 mg/kg桑叶提取均显著降低了肉鸡前期和后期血清和肝脏中TC含量，但其他指标，如TG、LDL-C和GLU的含量均无显著影响，表明桑叶提取物可能通过减少胆固醇在肝脏和血清中的含量，实现降低AA肉鸡腹脂沉积的作用。脂肪主要分为TG、TC、脂肪酸和类脂质。TG是机体储存能量的主要形式，血清TG含量代表了动物脂肪沉积的能力；胆固醇主要合成和储存于肝脏，血清TC含量是血液中脂蛋白所含胆固醇的总和，可作为脂肪代谢的主要指标；血清LDL-C合成于肝脏，是血液转运肝脏合成的内源性胆固醇运至肝外组织的重要脂蛋白，是保证机体对胆固醇的需要的重要载体。另外，肝脏TC、TG也是反映肝脏中脂肪代谢的重要指标。肝脏中脂肪代谢的稳态对于机体健康至关重要，当体内脂肪和胆固醇过多时，则不能被完全代谢，并大量沉积在肝脏和腹部[11]，导致脂肪肝和腹部脂肪沉积[12-13]。本研究结果与桑叶及其加工产物在其他动物生产上的应用基本一致。樊路杰[14]研究发现，添加桑叶或发酵桑叶可极显著降低育肥猪血清TC、TG、LDL-C的含量，极显著提高血清中HDL-C的含量，表明桑叶和发酵桑叶可以提高育肥猪脂肪代谢能力，Lee等[15]在小鼠中也有类似发现。黄静等[6]研究发现，饲粮添加20%的桑叶粉可显著降低胡须鸡血清中TC、TG含量。侯启瑞等[16]的研究结果显示，桑叶粉和桑叶DNJ提取物显著降低了鹅血液中的TG含量，但对血液中TC、LDL-C和HDL-C含量无显著影响，提示DNJ是桑叶中影响动物脂肪代谢的重要功效物质，而本试验中所使用的桑叶提取物中也含有DNJ，这可能是其有效降低AA肉鸡腹脂沉积的功能性物质之一。

进一步对肝脏中与脂肪代谢合成与分解途径相关基因的研究发现，桑叶提取物对AA肉鸡腹脂沉积、血清和肝脏中TC含量的降低，与肝脏中脂肪酸合成过程中的AMPK信号路径有关，而与分解途径相关性不大。

AMPK作为机体调控能量和脂类代谢的重要信号路径，可通过直接磷酸化SREBP-1c的相应靶点，从而下调SREBP-1c基因的表达，起到抑制脂肪的合成作用[17-18]。而SREBP-1c作为细胞中脂肪代谢主要转录调控因子，可直接调控ACC和FAS等脂肪合成相关酶的基因表达水平，调节脂肪酸和TG合成，具有生脂作用。如对小鼠的研究表明，SREBP-1c基因的过表达可促进肝脏中TG和胆固醇的沉积[19]。FAS是长链脂肪酸聚合过程中的关键酶，与肝脏脂肪酸合成密切相关[20]；ACC在调节机体脂肪酸合成和代谢方面起着重要作用，抑制ACC的活性可起到减少机体中脂肪合成、增强脂肪酸氧化的效果[21]。本研究结果显示，桑叶提取物显著上调了肉鸡肝脏中AMPKα的mRNA相对表达量，下调了SREBP-1c、ACC、FAS的mRNA相对表达量，有效减少了肝脏中胆固醇的沉积。该结果提示，桑叶提取物发挥降低AA肉鸡腹脂沉积的功效可能是通过AMPKα的激活，经过AMPK/SREBP-1c/ACC信号通路，降低ACC和FAS等相关酶的表达，通过减少肝脏中的脂肪酸合成，从而降低肉鸡血脂和腹脂沉积，如图1所示。

AMPKα:腺苷酸活化蛋白激酶α AMP-activated protein kinase α;SREBP-1c:固醇调节元件结合蛋白-1c sterol regulatory element binding protein-1c;ER:内质网 endoplasmic reticulum;SRE:启动子区域SRE元件 promoter region SRE element; FAS:脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase; ACC:乙酰辅酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase;TC:总胆固醇 total cholesterol。

在脂肪酸氧化分解方面，本试验检测了转录因子PPARα及其调控的相关基因ACO、CPT1α、LPL和L-FABP的mRNA相对表达量。PPARα属于核激素受体家族，能够通过促进脂肪酸β氧化和调节脂蛋白代谢来发挥调控机体脂肪代谢的作用。PPARα可通过调控CPT1α和ACO等的基因表达和酶活性，从而调节机体内β氧化[22]。在啮齿动物中，PPARα可通过多种机制改善胰岛素抵抗，增强胰岛素敏感性，进一步增强肝脏脂肪酸氧化酶表达水平来实现降脂作用[23]。代泓钰等[24]的研究表明，桑叶水提物可能通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶/苏氨酸激酶/过氧化物酶体增殖物激活受体α/肉碱棕榈酰转移酶-1(PI3K/Akt/PPARα/CPT-1)信号通路有效改善大鼠肝脏糖、脂代谢和胰岛素抵抗。Tang等[25]的研究发现，桑叶水提物可通过激活AMPK和PPARα信号通路减少小鼠肝脏脂质合成和累积，对酒精诱导的肝脏损伤具有保护作用。

但本研究结果显示，饲粮中添加桑叶提取物对肉鸡肝脏中PPARα、CPT1α、ACO、LPL和L-FABP等mRNA相对表达量无显著影响。这表明与啮齿动物不同，桑叶提取物在家禽中实现降脂功效主要是通过抑制脂肪酸的合成[21,26]，而非通过脂肪的氧化分解来实现的。

4 结 论

综上所述，桑叶提取物有效减少AA肉鸡腹脂的沉积，其作用原理与AMPK/SREBP-1c/ACC信号通路有关，通过上调肝脏中AMPKα的基因表达和下调SREBP-1c及其下游与脂肪酸合成相关酶FAS、ACC的基因表达，通过减少肝脏和血清中胆固醇含量，从而实现降低肉鸡腹脂沉积的作用。本试验中，桑叶提取物对AA肉鸡发挥降脂作用的适宜添加量为800～1 200 mg/kg。