肠道菌群介导半乳糖促进小鼠采食的机制研究

2022-12-08陈履双朱树庆谢开来冯霞洁孙中华王丽娜

动物营养学报 2022年11期

陈履双朱树庆谢开来冯霞洁吴鑫孙中华王丽娜

(华南农业大学动物科学学院，广东省动物营养调控重点实验室，广州 510642)

糖类(碳水化合物)是食物中的重要组成部分，也是大多数生命机体重要的能量来源。一般情况下，人类饮食中碳水化合物含量占比50%以上，而作为畜禽饲料主要原料的玉米中含有碳水化合物在70%以上。此外，在生猪养殖的过程中，还有一些糖类被用作添加剂使用，如在仔猪饲粮中添加低聚木糖可以促生长、改善仔猪的料重比等生长性能[1]。饲粮中添加甘露寡糖可以提高动物的免疫机能和生产性能[2]，可见糖类对于动物机体而言具有至关重要的作用。半乳糖作为乳汁的主要成分之一，是新生儿的主要营养素，许多研究证明新生儿相对成人来说能更好地利用半乳糖，并且新生儿的半乳糖同化超过葡萄糖[3]。半乳糖已知的应用主要包括作为大脑衰老模型的处理物[4]、低能量甜味剂生产的原料[5]以及药物的前体和载体[6]等。半乳糖进入体内后通过钠/葡萄糖共转运体1(sodium/glucose cotransporter 1，SGLT1)活跃地跨膜转运。2个钠离子首先结合到转运体的外表面，导致形成变化，允许半乳糖结合，然后通过葡萄糖转运体2(glucose transporter 2，GLUT2)的被动过程通过基底外侧膜转运。半乳糖从肠细胞运输后，进入门静脉并运输到肝脏，然后在肝脏中被GLUT2内化[7]。与葡萄糖和果糖的氧化途径相比，半乳糖优先并入肝糖原，大多数研究表明，肝脏似乎是半乳糖代谢的最重要器官，然而最近发现参与半乳糖代谢的酶在其他一些细胞和组织中也有检测出来[8]。

在畜牧生产中，含有乳糖的干乳清和脱脂奶粉常被添加在饲粮中来缓解断奶仔猪的应激。研究表明，乳糖是一种能显著影响断奶仔猪采食量的重要营养物质，谷物和植物蛋白质型饲粮中添加干乳清和脱脂奶粉等乳制品可以提高仔猪的生长性能。也有研究显示，饲粮中添加乳糖可以改善仔猪肠道形态，提高仔猪十二指肠绒毛高度[9]，并且乳糖可以选择性地刺激嗜酸细菌生长，增加乳酸菌产量，从而调节微生物组成，表现出更大的增重和更好的饲料效率[10]；另有研究显示，海参多糖能够通过正向调节宿主肠道微生物群及其代谢物来缓解糖尿病，包括增加有益细菌的丰度和短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)的浓度以及减少病原菌。近年来由于饮料和加工食品中大量的高果糖玉米糖浆的使用，果糖的消耗量显著增加。近期研究发现，肠道菌群可以消耗果糖转化为乙酸盐，减轻了肝脏的负担以及脂肪肝发生的几率[11]。然而，半乳糖是否能够改善饲粮适口性促进动物生长、调控动物的肠道健康还未见报道。因此，本研究通过饮水添加和剂量筛选以及后续的菌群测序和代谢组学检测来探索半乳糖对于动物生长、肠道菌群和代谢物的影响，为半乳糖在动物生产中的应用提供新的理论及试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

下丘脑神经肽Y(NPY)-绿色荧光蛋白(GFP)/阿片-促黑素细胞皮质素原(POMC)-GFP转基因小鼠，初代购自美国Jackson实验室；3周龄SPF级C57/BL6J小鼠，购自广东省医学实验动物中心。猪肠上皮细胞(IPEC-J2)由吉林大学动物科学学院转赠。半乳糖购自上海生工生物有限公司，纯度>98%；乳酸、青霉素、链霉素和甲硝唑购自上海生工生物有限公司；异丁酸、2-苯丙酸和氢化肉桂酸购自美国Sigma公司。

1.2 试验设计

1.2.1 剂量筛选试验

选用40只3周龄C57/BL6J公鼠，预饲维持饲粮1周后按体重随机分为4组，每组10只。对照组给予饮用双蒸水，试验组分别给予半乳糖浓度为0.5%、1.0%和1.5%的饮水，添加剂量由本实验室前期筛选确定。每3 d更换1次饮水，每周测量其采食量及体重，计算平均日采食量。试验期4周。

1.2.2 饮水添加1.0%半乳糖对下丘脑神经元兴奋性的影响

通过剂量筛选试验，得出饮水中半乳糖的适宜浓度为1.0%。选取6只NPY-GFP小鼠，按体重分为2组，每组3只，以及6只POMC-GFP小鼠，按体重分为2组，每组3只，对照组给予饮用双蒸水，试验组给予添加1.0%半乳糖的饮水。每3 d更换1次饮水，1周后使用异氟烷麻醉取全脑，进行免疫荧光试验，通过计算c-Fos阳性神经元与NPY/POMC神经元共定位数量，判定被兴奋的神经元类型。

1.2.3 伪无菌小鼠模型验证试验

选用32只3周龄C57/BL6J公鼠，随机分为4组，每组8只，对照组给予饮用双蒸水，半乳糖组给予添加1.0%半乳糖的饮水，半乳糖+抗生素组给予添加1.0%半乳糖+0.3%抗生素(0.1%青霉素、0.1%链霉素和0.1%甲硝唑)的饮水，抗生素组给予添加0.3%抗生素(0.1%青霉素、0.1%链霉素和0.1%甲硝唑)的饮水，每3 d更换1次饮水，每周测量其采食量和体重，计算平均日采食量。试验期4周。

1.3 饲养管理

所有小鼠单笼饲养，自由采食和饮水，每日昼夜各12 h，环境温度控制在25 ℃左右，相对湿度控制在60%左右。

1.4 样品采集

4周后，每组选取3只小鼠进行心脏灌流，以获取小鼠下丘脑切片样，其余7只进行眼部采血，后断颈处死，收集十二指肠、空肠、回肠和结肠的肠道内容物、肠道黏膜及肠道组织样品，液氮冷冻后储存在-80 ℃冰箱中备用。

1.5 试验方法

1.5.1 小鼠体成分检测

轻微刺激小鼠尾根部使其排尽尿液及粪便，将小鼠置于与仪器配套的圆筒中固定住小鼠，然后将圆筒慢慢推进活体动物体成分检测仪中进行体组成测定，记录小鼠肌肉和脂肪的重量及比例。

1.5.2 小鼠整体能量代谢检测

小鼠单笼饲养于小动物代谢监测系统设备中，自由饮水及进食，系统温度湿度及昼夜节律与鼠房保持一致。小鼠在系统中适应24 h后，在随后的48 h内监测能量消耗、呼吸熵及自由活动量。

1.5.3 总RNA抽提和实时荧光定量PCR检测

组织样品和细胞样品均使用总RNA抽提试剂盒进行抽提，细胞样品抽提前每孔取适量无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗3次，抽提的具体步骤按照试剂盒说明书进行。用核酸浓度测定仪测定抽提出的总RNA的浓度，取1 μg总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检测RNA完整性。将RNA反转成cDNA，采用荧光定量PCR方法检测相关目的基因相对表达量，取稀释后的样品cDNA模版各3 μL，上、下游混合引物1 μL，2×Real-time PCR SYBR Green 10 μL，补水至20 μL。将96孔PCR板置于实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher, 美国)中，按以下程序进行热循环：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、51～62 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。内参基因为β-肌动蛋白，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。实时荧光定量PCR引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

续表1基因 Genes引物序列 Primer sequence (5’—3’)鼠 Mice猪 Sus scrofa白细胞介素-6 F:GCCTTCTTGGGACTGATGCTF:CGGATGCTTCCAATCTGGGTIL-6R:TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGGR:CAGGTGCCCCAGCTACATTA白细胞介素-8 F:CTAGGCATCTTCGTCCGTCF:TGCAGAACTTCGATGCCAGTIL-8R:AGCCCATAGTGGAGTGGGATR:AATTCTTGGGAGCCACGGAG白细胞介素-10 F:GCTCCAAGACCAAGGTGTCTF:TCAAACGAAGGACCAGATIL-10R:AGGACACCATAGCAAAGGGCR:GAAGATGTCAAACTCACCC白细胞介素-13 F:TGCCATCTACAGGACCCAGAF:CTGACCACCAGCATGCAGTAIL-13R:CTCATTAGAAGGGGCCGTGGR:AGACAGCACAGGCTCAAGTC白细胞介素-17 F:GCTGACCCCTAAGAAACCCCF:TCCTGTGAGATCCTCGTCCCIL-17R:GAAGCAGTTTGGGACCCCTTR:ATGATTCCCGCCTTCACGAGβ-肌动蛋白 β-actinF:GGACTTCGAGCAGGAGATGGR:AGGAAGGAGGGCTGGAAGAGF:ACTCACTCTTCTACCTTR:TGTTGCTGTAGCCAAATTCA

1.5.4 蛋白的提取和Western blot检测

组织总蛋白和细胞总蛋白均采用放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液抽提，组织样品加入500 μL含有10 mmol/L的蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行匀浆，后转移至离心管并在4 ℃，15 294×g转速下离心15 min；细胞样品加入100 μL含有2 mmol/L的蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，4 ℃放置30 min后用移液器刮下细胞，转移至离心管并在4 ℃，15 294×g转速下离心15 min。蛋白浓度用BCA试剂盒测定，具体步骤按照试剂盒使用说明书进行，细胞蛋白分装变性后于-80 ℃保存备用。在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离后，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后将膜放在含6%脱脂奶粉中封闭2 h。然后在4 ℃下一抗孵育过夜，第2天用对应的二抗室温孵育1.5 h。使用荧光成像系统测量蛋白质表达并标准化。

1.5.5 免疫荧光化学检测

用异氟烷麻醉小鼠，并用4%多聚甲醛经心脏灌注，立即收集大脑并在冰冷的4%多聚甲醛中固定过夜，然后将其在30%蔗糖中脱水。在冰冻切片机中将所需脑区切成约25 μm厚的冠状脑切片，将切片在PBS中清洗3次，每次10 min。然后，将切片在含5%羊血清的3,3-双(叠氮甲基)氧杂环丁烷-四氢呋喃共聚物(PBT)-叠氮化物中封闭2 h。将一抗添加到切片中，然后在室温下在振荡器上过夜。第2天，在室温下避光孵育二抗约1.5 h，封片，之后在免疫荧光显微镜下观察荧光强弱并拍照。随后在图像处理软件Adobe Photoshop中使用计数工具统计每张脑片中绿色荧光神经元数量，以及与绿色荧光神经元共定位的红色荧光原癌基因蛋白c-Fos(神经元兴奋标志物)数量，并计算后者与前者比值作为最后统计数据。

1.5.6 微生物测序和代谢组学检测

微生物测序和代谢组学及两者相关性分析均由上海麦特绘谱生物科技有限公司完成。微生物测序和代谢组学均使用小鼠空肠内容物检测。微生物测序使用Illumina测序平台，利用双末端测序(paired-end)的方法，构建小片段文库进行测序，微生物多样性生物信息分析在Linux平台上完成。使用宏代谢组学分析质谱仪进行代谢组学检测，统计各类代谢物相对丰度，并采用单维检验(依据数据的正态性和方差齐性选取t检验或Mann-Whitney U检验)来获得2组间的差异代谢物。

1.5.7 肠道炎症因子含量检测

肠道中白细胞介素(IL)-4、IL-6和IL-10含量由定制MSD多因子检测试剂盒进行检测，试剂盒购自上海优宁维生物科技有限公司。

1.5.8 IPEC-J2细胞的复苏和处理培养

1)细胞复苏：将细胞冻存管从液氮中拿出后迅速放进37 ℃水浴锅中解冻，溶解后转移至15 mL离心管中，4 ℃，129×g离心5 min，离心结束后弃上清，加入完全培养基进行重悬，最后转移至细胞培养瓶中进行培养。

2)处理培养：复苏后的细胞经过1～2次传代，待状态好的细胞长至90%进行接板，细胞消化重悬后进行细胞计数，然后以1×104个/cm2的密度接到12孔板中，细胞分为5组，每组6个重复，待细胞长至60%进行处理，4个组分别添加已筛选出的肠道差异代谢物异丁酸(500 μmol/L)、2-苯丙酸(10 μmol/L)、氢化肉桂酸(10 μmol/L)和乳酸(500 μmol/L)，对照组给予相同体积的PBS，24 h换液，48 h后收板检测。

1.6 统计分析

采用Graphpad 7.0统计软件分析文中柱状图所涉及数据，统计方法采用t检验；采用SPSS 23.0统计软件分析文中三线表中所涉及数据，半乳糖添加剂量与小鼠体重相关性采用回归分析，抗生素与半乳糖共处理试验数据采用双因素方差分析(two-way ANOVA)，多重比较采用最小显著差异(LSD)法，试验中所有数值均采用平均值±标准误表示，P<0.05和P<0.01分别为差异显著和差异极显著判定标准。

2 结果与分析

2.1 饮水添加半乳糖对小鼠采食量、体重及能量代谢的影响

由图1可知，与对照组相比，小鼠饮水中分别添加0.5%、1.0%和1.5%半乳糖均能极显著提高小鼠平均日采食量(P<0.01)，而体重和体组成虽统计学分析无显著影响(P>0.05)，但从表2的半乳糖添加剂量与小鼠体重回归分析结果可以看出，小鼠体重与半乳糖添加剂量呈显著正相关(P<0.05)，小鼠体重随半乳糖添加剂量增加而呈升高趋势。由于1.0%的半乳糖添加剂量相对于0.5%的添加剂量有更好的促进采食作用，且相对于1.5%的添加剂量效果更稳定(图1-A)，故后续试验均以1.0%的添加剂量进行半乳糖处理。

*表示差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01)，无标注表示差异不显著(P>0.05)。下同图。

表2 半乳糖添加剂量与小鼠体重回归分析模型

能量代谢方面，与对照组相比，饮水添加半乳糖能极显著增加小鼠氧气消耗量(图2-A和图2-B)、二氧化碳排放量(图2-C和图2-D)和能量消耗水平(图2-G和图2-H)(P<0.01)，而对呼吸熵无显著影响(P>0.05)(图2-E和图2-F)。

图2 饮水添加半乳糖对小鼠整体能量代谢的影响

2.2 饮水添加半乳糖对小鼠下丘脑弓状核中神经元兴奋性的影响

为了确定饮水添加半乳糖后下丘脑弓状核神经元兴奋性，本试验选用NPY/POMC-GFP的小鼠进行下丘脑c-Fos染色。结果发现，饮水添加1.0%半乳糖极显著提高了小鼠NPY神经元的兴奋性(P<0.01)(图3-A和图3-B)，但是对POMC神经元的兴奋性无显著影响(P>0.05)(图3-C和图3-D)。

NPY:下丘脑神经肽Y hypothalamic neuropeptide Y；POMC:阿片-促黑素细胞皮质素原 proopiomelanocortin; Merge：合并。A为NPY-GFP小鼠饮水添加1.0%半乳糖后c-Fos与NPY神经元共定位情况；B为共定位c-Fos数量占NPY神经元的比例统计图；C为POMC-GFP小鼠饮水添加1.0%半乳糖后c-Fos与POMC神经元共定位情况；D为共定位c-Fos数量占POMC神经元的比例统计图。A was the co-localization of c-Fos and NPY neurons in NPY-GFP mice after drinking water and adding 1.0% galactose; B was the proportion of co-localized c-Fos in NPY neurons; C was the co-localization of c-Fos and POMC neurons in POMC -GFP mice after drinking water and adding 1.0% galactose; D was the proportion of co-localized c-Fos in POMC neurons.

2.3 饮水添加半乳糖对小鼠肠道糖转运代谢相关基因表达及炎症通路的影响

由图4可知，与对照组相比，饮水添加半乳糖显著或极显著降低了小鼠肠道SGLT1(P<0.01)和葡萄糖转运体1(GLUT1)(P<0.05)的基因相对表达量(图4-A)，但却显著提高了半乳糖激酶(GALK)的基因相对表达量(P<0.05)(图4-B)，这说明试验组小鼠转运到肝脏的半乳糖减少，更多的半乳糖在肠道内通过Leloir途径进行代谢。

与此同时，与对照组相比，试验组小鼠肠道内促炎因子IL-1β(P<0.05)、IL-4(P<0.01)、IL-6(P<0.05)、IL-8(P<0.01)和IL-17(P<0.05)基因相对表达量均显著或极显著降低(图4-C)，并且抗炎因子IL-10和IL-13基因相对表达量也极显著降低(P<0.01)(图4-D)，可能由于机体的反馈调节导致促炎因子降低后抗炎因子也随之降低。随后对肠道中IL-4、IL-6和IL-10的含量进行检测发现，与对照组相比，试验组小肠IL-4(P<0.05)、IL-6(P<0.01)和IL-10(P<0.05)的含量均显著或极显著降低(图4-E至图4-G)，与基因表达结果趋势一致。此外，Western blot结果显示，与对照组相比，肠上皮细胞炎症信号通路蛋白蛋白酪氨酸激酶(JAK)、蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化水平显著降低(P<0.05)(图5-A至图5-F)。

SGLT1：钠/葡萄糖共转运体 sodium/glucose cotransporter 1；GLUT1：葡萄糖转运体1 glucose transporter 1；GLUT2：葡萄糖转运体2 glucose transporter 2；GALK：半乳糖激酶 galactokinase；GALT：半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 galactose-1-phosphouridine transferase；GALE：尿苷二磷酸4′-变构酶 uridine diphosphate 4′-allosteric enzyme；IL：白细胞介素 interleukin。A和B分别为空肠半乳糖转运载体(SGLT1、GLUT1和GLUT2)和半乳糖代谢酶(GALK、GALT和GALE)基因相对表达量；C和D分别为肠道中促炎因子和抗炎因子的基因相对表达量；E、F、G分别为肠道中IL-4、IL-6和IL-10的含量。A and B were the relative expression levels of galactose transporter (SGLT1,GLUT1和GLUT2)and galactose metabolizing enzyme(GALK,GALT和GALE) genes in jejunum, respectively; C and D were the relative expression levels of proinflammatory and anti-inflammatory factors genes in the intestine, respectively; E,F,G were the contents of IL-4, IL-6 and IL-10 in the intestine.

2.4 饮水添加半乳糖对小鼠肠道菌群及代谢物的影响

对小鼠空肠内容物进行微生物测序分析，LEfSe分析结果显示，半乳糖组中疣微菌门(Verrucomicrobia)和奈瑟菌科(Neisseriaceae)的细菌相对丰度显著升高(P<0.05)(图6-A)，包括其中的阿克曼菌属(Akkermansia)、斯巴杆菌纲(Spartobacteria)、红杆菌目(Chthoniobacterles)、DA101(不明菌群，属于疣微菌门)、沙雷氏菌属(Serratia)、奈瑟菌属(Neisseria)和肠球菌属(Enterococccus)，并且降低了罗氏菌属(Rothia)和月形单胞菌属(Selenomonas)的相对丰度(图6-B)。

β-action:β-激动蛋白；JAK：蛋白酪氨酸激酶 protein tyrosine kinase；STAT3：信号转导因子和转录激活因子3 signal transducers and activators of transcription 3；JNK：c-Jun氨基末端激酶 C-Jun N-terminal kinase；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；ERK：细胞外信号调节激酶 extracellular signal-regulated kinase。

Verrucomicrobiae:疣微菌纲; Verrucomicrobiaceae：疣微菌科；Akkermansia：阿克曼菌属；Spartobacteria: 斯巴杆菌纲；Chthoniobacterles：红杆菌目；Chthoniobacteraceae：红杆菌科；Serratia: 沙雷氏菌属；Neisseria：奈瑟菌属；Neisseriales：奈瑟菌目；Neisseriaceae:奈瑟菌科；Enterococccus:肠球菌属；Rothia：罗氏菌属；Selenomonas:月形单胞菌属; Other：其他；s_unclassified: 未分类。A为LEfSe分析差异物种辐射图(图中由内至外辐射的圆圈代表了由门至属的分类级别，中心黄色圈代表界，不同分类级别上的每1个小圆圈代表该水平下的1个分类，小圆圈的直径大小代表了相对丰度的大小)；B为LEfSe分析差异菌群柱状图(红色柱子表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群，蓝色柱子表示在蓝色组别中起到重要作用的微生物类群)。A was the radiation map of different species analyzed by LEfSe (the circle radiated from inside to outside represents the classification level from phylum to genus, the central yellow circle represents the boundary, each small circle on different classification levels represents a classification under this level, and the diameter of the small circle represents the size of relative abundance); B was the histogram of different flora in LEfSe analysis (the red column indicates the microbial groups that play an important role in control group, and the blue column indicates the microbial groups that play an important role in galactose group).

随后代谢组学检测发现，半乳糖组中有机酸和短链脂肪酸(SCFAs)2类代谢物相对丰度显著高于对照组(P<0.05)(图7-A)，其中包括异丁酸、乳酸、2-苯丙酸、氢化肉桂酸、酮亮氨酸、乙醇酸、核酮糖和甘油酸，并且己二酸和牛磺鼠胆酸(TaMCA/TbMCA)的相对丰度显著降低(P<0.05)(图7-B)。

Carbohydrates：碳水化合物；Amino acids：氨基酸；Bile acids：胆汁酸；Fatty acids：胆汁酸；Organic acids：有机酸；SCFAs:短链脂肪酸；Benzenoids:苯型烃类;Pyridines:吡啶类;Phenylpropionic acids：苯丙酸；Carnitines:肉碱；Benzoic acids:苯甲酸；Phenols:酚类；Imidazoles:咪唑；Indoles:吲哚；Isobutyric acids：异丁酸；Lactic acids：乳酸；2-phenylpropionate：2-苯丙酸；Hydrocinnamic acid：氢化肉桂酸/3-苯丙酸；Ketoleucine：酮亮氨酸；Glycolic acid：乙醇酸；Glyceric acid：甘油酸；Adipic acid：己二酸；Ribulose：核酮糖; TaMCA/TbMCA：己二酸/牛黄鼠胆酸 adipic acid /taurine cholic acid。图7同 the same as Fig.7。A为各代谢物类别的相对丰度；B为差异代谢物单维代谢火山图(图中右上角红色表示代谢物相对丰度在半乳糖组中升高，左上角蓝色表示代谢物在半乳糖组中降低)。A was the relative abundance of each metabolite category; B was the one-dimensional metabolic volcano map of differential metabolites (the red dot in the upper right corner indicated that the metabolites were increased in the galactose group, and blue dot in the upper left corner indicates that the metabolites were decreased in the galactose group).

对肠道微生物测序结果与代谢组中各差异代谢物进行相关性分析可以发现，半乳糖组中升高的酸类代谢物含量均与可以发酵糖类产酸的沙雷氏菌相对丰度呈显著正相关，而苯类代谢物含量均与联苯降解菌DA101相对丰度呈显著正相关(图8-A和图8-B)。

进一步的研究发现，与对照组相比，小鼠饮水添加半乳糖显著或极显著提高了肠道中脂肪酸受体GPR41(P<0.01)和GPR43(P<0.05)的基因相对表达量(图9-A和图9-B)。

2.5 半乳糖差异代谢物对IPEC-J2细胞炎症信号的影响

为了探究半乳糖是否通过其代谢物异丁酸(IBA)、乳酸(LA)、2-苯丙酸(2-PA)和氢化肉桂酸(HA)等发挥作用，使用IPEC-J2细胞作为试验对象，检测上述代谢物对细胞炎症因子的调控作用。结果显示，几种代谢物均能调控细胞的炎症状态，与对照组相比，其中异丁酸显著或极显著降低了细胞中IL-6(P<0.05)和IL-8(P<0.01)的基因相对表达量(图10-A)，而另外3种处理物则同时显著或极显著升高了细胞中促炎因子IL-8和抗炎因子IL-10的基因相对表达量(P<0.05或P<0.01)(图10-B、图10-C和图10-D)。由定量结果可知，半乳糖代谢物中异丁酸具有较强的抑制炎症作用，随后对异丁酸处理的细胞同样检测上述几种蛋白表达，结果显示，异丁酸处理后细胞中JAK和AKT蛋白表达水平同样显著降低(P<0.05)(图10-H和图10-I)。

2.6 抗生素处理可消除半乳糖的促进采食作用

依据以上结果，猜测半乳糖可能是通过调控肠道菌群相对丰度及代谢物含量来发挥促进采食的作用，所以，本试验对小鼠进行抗生素添加来清除小鼠的肠道微生物，由表3可知，失去肠道微生物后半乳糖促进采食的作用被消除，初步验证了本试验的猜想。

A为肠道菌群和差异代谢物相对丰度的相关性分析热图(暖色表示正相关，冷色表示负相关)；B为相关性显著的菌群和代谢物的网状图。A was the heat map of correlation analysis between intestinal flora and metabolites (warm color indicates positive correlation and cold color indicates negative correlation); B was the network diagram of bacterial flora and metabolites with significant correlation.

GPR41：G蛋白偶联受体41 G protein coupled receptor 41；GPR43：G蛋白偶联受体43 G protein coupled receptor 43。

3 讨论

乳糖在生产中常用于过渡仔猪断奶应激，促进仔猪采食量并改善肠道健康[12]，而半乳糖作为乳糖的组成单糖之一，可能与乳糖有相似地改善肠道健康的功效。本研究发现，饮水中添加0.5%、1.0%和1.5%的半乳糖均会显著提高小鼠的平均日采食量，其中1.0%的添加剂量效果较好，并且小鼠体重与半乳糖添加剂量呈显著正相关，随着半乳糖添加剂量增加小鼠体重有上升趋势。糖类对于动物采食行为的影响已有较多报导，蔗糖由于其发现早、易提取以及甜度高的特性在生产、生活中使用率较高。在成年男性的一项研究中表明，蔗糖会在短期内抑制食欲[13]，另一项研究也表明，饮用蔗糖后其他能量摄入会减少，但是包括蔗糖在内的总能量摄入量没有变化[14]。除蔗糖外，葡萄糖在机体中的作用更为重要，研究表明，餐前进食葡萄糖会抑制食物摄入量，饱腹感是食物摄入减少的关键，进食蔗糖或葡萄糖后脑内葡萄糖水平升高，所以饱腹感升高抑制采食量[15]。在大脑中，丙二酰辅酶A具有监测和调节能量平衡的重要功能，研究发现葡萄糖处理会导致下丘脑ATP水平升高，同时单磷酸腺苷(AMP)水平降低，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)失活，丙二酰辅酶A活性增加，从而抑制食物摄入[16]。但另一研究表明，在小鼠大脑室旁核中注射葡萄糖会促进禁食18 h小鼠的采食量，并且这种作用可能是通过血浆瘦素和生长素释放肽水平的中枢神经系统调节机制介导的[17]。与蔗糖、果糖等高甜度高热量糖类相比，半乳糖低热量的特点使其进入胃肠道后不易引起饱腹感。而半乳糖和葡萄糖同为组成乳糖的单糖之一，对于动物生长和采食量的影响及作用途径也大不相同，从本研究的结果来看，相比于葡萄糖，乳糖的功效或许更依赖于半乳糖，这也提示半乳糖可能在肠道健康中发挥重要作用。

IBA：异丁酸 isobutyric acid；LA：乳酸 lactic acid；2-PA：2-苯丙酸 2 - phenyl propionic acid；HA：氢化肉桂酸 hydrocinnamic acid；JAK：蛋白酪氨酸激酶 protein tyrosine kinase；STAT3：信号转导因子和转录激活因子3 signal transducers and activators of transcription 3；JNK：c-Jun氨基末端激酶 C-Jun N-terminal kinase；PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；AKT：蛋白激酶B protein kinase B；ERK：细胞外信号调节激酶 extracellular signal-regulated kinase; β-action:β-激动蛋白。A～D分别为IBA、LA、2-PA和HA对肠道炎症因子基因相对表达量的影响；E～J分别为IBA对细胞中JAK、STAT3、PI3K、AKT、JNK和ERK蛋白表达的影响。

表3 抗生素处理可消除半乳糖的促采食作用

本研究中16s rDNA高通量测序的结果发现，饮水中的半乳糖增加了小鼠肠道中阿克曼菌属、斯巴杆菌纲和红杆菌目等细菌的相对丰度。肠道菌群在宿主的健康、抵御病原体、代谢饮食中的营养物质和药物、影响饮食中脂肪的吸收和分布等方面发挥着关键作用[18]，并且由于其组成的整体平衡性，微生物群落不仅在胃肠道范围内发挥作用，甚至可以通过脑-肠轴影响中枢神经系统[19]。作为近年来的一个研究热点，越来越多研究表明，阿克曼菌属具有预防和治疗肥胖症、2型糖尿病和其他代谢功能障碍的作用[20-21]。先前的研究发现，阿克曼菌属相对丰度与小鼠和人类的体重成反比[22]，这也与本试验结果相符，并且可通过诱导叉状头转录因子3(Foxp3)调节T细胞显著提高肥胖小鼠的葡萄糖耐量并减轻脂肪炎症[23-24]，证明了半乳糖有改善肠道菌群组成的作用。

在此基础上，代谢组学的研究发现，饮水中添加半乳糖之后，异丁酸等短链脂肪酸的含量增加，并且肠道中短链脂肪酸受体的基因表达水平显著升高，另外半乳糖处理显著降低了肠道中白细胞介素家族的部分炎症因子的基因表达，包括促炎因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8和IL-17以及抗炎因子IL-10和IL-13。异丁酸属于一种短链脂肪酸，短链脂肪酸的形成是饮食和肠道微生物群之间复杂相互作用的结果，并且主要通过碳水化合物的发酵产生。越来越多研究证明了短链脂肪酸在调节免疫系统和炎症反应中发挥作用，研究表明，短链脂肪酸是维持结肠上皮的重要底物，尤其是丁酸盐，并且丁酸盐已被证明可逆转紧密连接蛋白-1(ZO-1)的异常表达并减少脂多糖(LPS)易位，从而抑制巨噬细胞活化、促炎细胞因子产生和中性粒细胞浸润，从而减轻大鼠的肝脏损伤[25]。已有众多研究证实，短链脂肪酸通过不同机制上调抗炎和下调促炎细胞因子，从而促进黏膜稳态，从而具有全面的抗炎作用[26]。也有研究表明，短链脂肪酸受体GPR41和GPR43在炎症反应中起重要作用，丙酸盐可以通过GPR41抑制IL-4、IL-5和IL-17A的表达[27]，丁酸盐可以抑制诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6和单核细胞趋化蛋白1的表达[28]。随后的炎症相关信号通路研究结果显示，在体试验中半乳糖处理显著降低了小鼠肠道JAK、AKT和ERK蛋白的磷酸化水平，异丁酸处理的细胞中JAK和AKT蛋白磷酸化水平也显著降低，说明JAK和AKT在半乳糖降低炎症的过程中可能发挥重要作用。大量研究表明，高糖尤其是果糖和蔗糖等高热量的饮食以及高脂和低膳食纤维的饮食习惯均会引起肥胖和代谢综合征[29-30]，而这也是引起肠道炎症、结肠癌和炎症性肠病的重要因素[31-32]。但本研究中半乳糖不但不会引起机体肥胖和肠道炎症，反而可以降低肠道炎症，改善肠道健康，这可能是半乳糖作为一种低热量糖特有的功效。