徐房添 赖仲宏 梁安儒

(1 赣南医学院第一附属医院骨科,江西省赣州市 341001；2 广西康久生物科技有限公司,广西南宁市 530201)

关节软骨损伤是由创伤、肥胖、退行性变等原因导致的关节软骨破坏[1]。据估计，全球超过25%的成年人有不同程度的关节软骨损伤，但由于关节软骨缺乏血管、神经和淋巴管，自我修复能力差，增殖活性和再生能力低等原因，关节软骨损伤后自行愈合非常困难，尤其是较大面积的软骨缺损，最终可能引起骨关节炎[2]。近年来，软骨组织工程的发展为软骨组织缺损的治疗提供了新的思路。软骨组织工程主要由三大部分组成：有效的软骨形成因子、充足的软骨形成祖细胞及种子细胞、良好的生物相容支架[3]。研究显示，骨髓干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)作为理想的种子细胞，在不同的诱导条件下可以向成软骨、成骨和成脂等方向分化，但其存在来源有限、取材困难、产量低、容易引起软骨骨化和诱导分化不完全等缺点，从而限制了BMSC的应用[4-5]。脂肪干细胞(adipose derived stem cell，ADSC)与BMSC有相似的特性，且其具有组织来源丰富、取材方便、免疫原性低、增殖速度快和具有多向分化潜能等优点，现已成为软骨组织工程研究的热点[6-7]。基于ADSC具有成软骨分化的特性，其可作为软骨组织工程的种子细胞，为软骨缺损治疗提供新的方案。本文将从ADSC的起源和特点、不同的生长因子及软骨组织工程支架等诱导ADSC成软骨分化的作用等方面作一综述。

1 ADSC的起源和特点

2001年Zuk等[8]从采用抽脂术提取的脂肪组织中分离获得一种在不同的诱导条件下可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等方向分化的细胞，将其命名为ADSC。研究表明，ADSC可调控免疫反应、伤口愈合、抗凋亡等过程，并能够减轻多种疾病的炎症反应，起到保护机体的作用[9-10]。与其他类型的干细胞相比，ADSC在自分泌某些生长因子和免疫调节剂方面更活跃，例如，ADSC表达的血管内皮生长因子-D、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和白细胞介素-8的mRNA水平高于BMSC、毛乳头细胞和真皮鞘细胞等其他间充质干细胞群[11]。因此,ADSC有望成为软骨组织工程及软骨修复最有前途的种子细胞之一。

2 ADSC成软骨分化的影响因素

2.1 生长因子 生长因子在ADSC的成软骨分化中发挥重要作用，目前常用的生长因子有转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、IGF-1、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等[12]。

2.1.1 TGF-β TGF-β是一类多功能的多肽类生长因子，具有促进ADSC生长、增殖、分化、凋亡以及免疫调节等功能。TGF-β与其受体结合后可使活化素受体激酶-5磷酸化，进而激活Smad通路,启动软骨特异性基因的转录，促进软骨细胞产生Ⅱ型胶原及软骨聚集蛋白聚糖表达，最终促使ADSC向软骨细胞分化[13]。有学者提出10 ng/mL TGF-β3和10 ng/mL BMP-6是诱导ADSC成软骨分化的“黄金搭档”，与单独使用TGF-β3相比，其更能有效地增强ADSC的成软骨分化潜能[14]。而对于TGF-β1和TGF-β3的诱导效能，有学者认为并无明显差异[15]。Li等[16]通过免疫组化和蛋白质印迹法证实TGF-β3可以诱导ADSC成软骨分化，刺激软骨细胞分化成熟，增加细胞外基质的合成，使Ⅱ型胶原、软骨聚集蛋白聚糖和SOX9的表达显著增加，进一步研究发现，其主要通过激活Wnt5a/β-catenin信号通路发挥作用。但目前TGF-β诱导ADSC成软骨分化的具体分子生物学机制还有待进一步研究。

2.1.2 BMP BMP是一组结构相似、高度保守的功能蛋白，可以促进ADSC向骨细胞和软骨细胞分化。有研究通过测量发现BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和BMP-9在正常软骨组织中高表达，提示在损伤的软骨组织中保持适当比例的BMP可维持或恢复软骨组织的健康动态平衡[17]。在BMP家族中，BMP-14被认为是当前诱导ADSC成软骨分化过程中最强的生长因子之一，在早期软骨形成以及后续多个阶段中都发挥着重要作用。Liu等[18]将BMP-14目的基因转染到ADSC，发现其能显著增加Ⅱ型胶原、软骨蛋白聚糖的表达，诱导ADSC向软骨细胞方向分化。目前，美国食品药物监督管理局批准将重组人BMP-2和BMP-7用于一些骨科疾病的治疗，如开放性骨折、骨不连、脊柱融合和颌面部骨骼增强等[17]。总之，BMP家族在软骨修复治疗中的应用已被广泛研究，并且取得了一些突破性的进展。然而，在将这些研究转化为治疗关节软骨缺损的新疗法之前，仍有许多问题需要研究解决。

2.1.3 IGF-1 IGF-1是一组能够促进细胞生长的多肽类物质，被认为是诱导软骨形成、调节细胞生长代谢最关键的细胞因子之一。IGF-1可以增强软骨细胞中Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖的表达，并且能够促进软骨细胞SOX9的表达，形成COL2A1；同时，其可通过抑制蛋白酶的生成和释放来减少ACAN的降解[19]。研究发现IGF-1基因的修饰能明显促进大鼠ADSC向软骨细胞分化[20]。

2.1.4 FGF FGF是一组可以促进细胞有丝分裂的重要因子，FGF参与胚胎发育中细胞的增殖、分化和迁移等过程。Nasrabadi等[21]研究发现FGF-2可降低碱性磷酸酶和Ⅹ型胶原的表达，抑制软骨细胞的肥大，并可增加TGF-β1/BMP-2诱导的软骨标志物，促进成软骨分化。然而也有学者提出，在与生长因子联合诱导过程中FGF-2抑制了BMP-6诱导成软骨分化的能力[22]。目前对FGF-2在诱导软骨形成方面的作用尚存在争议，还需进一步研究。

2.1.5 扩张因子 扩张因子是表皮生长因子、FGF-2和TGF-β1的统称，其可以增强干细胞的成软骨分化。研究显示扩张因子促进了Ⅱ型胶原的强健表达，但也增加了Ⅰ型和Ⅹ型胶原的沉积，这与肥大的软骨细胞表型一致[23]。

2.2 软骨组织工程支架 近年来随着科技的发展，生物支架材料已成为软骨组织工程研究的热点[24]。用于软骨组织工程的支架材料主要包括天然支架材料、人工支架材料和复合支架材料。天然可降解高分子有机材料更接近人体天然组织的结构和成分，具有良好的生物相容性，但机械强度较差，容易降解。人工合成可降解材料可以高精度制备，其机械性能、孔隙率、降解速率可控，来源充足；其主要缺点在于缺乏生物活性，细胞诱导分化能力较差，降解产物存在一定的毒副作用，免疫原性较强。

Pacelli等[25]研究发现海藻酸盐水凝胶有利于维持软骨细胞表型和促进新软骨组织生成，通过调节海藻酸盐的浓度，可以有效地提高构建体中干细胞成软骨分化的效率，维持软骨的特异性表型，抑制肥大软骨基因表达和成骨分化。与此同时，Cao等[26]通过构建关节软骨缺损模型以鉴定羊膜/胶原复合支架对软骨修复的影响，结果发现羊膜/胶原复合支架促进了ADSC的增殖和软骨分化。因此，在软骨组织工程中复合支架材料的应用可能更有利于ADSC成软骨分化。

2.3 其他因素 在诱导ADSC成软骨分化的过程中，还受到诸多因素的影响，如供体的年龄、取材部位、低氧、细胞代数等[27-28]。关于年龄对诱导ADSC成软骨分化能力的影响目前尚有争议，大部分学者认为ADSC成软骨分化能力随着供体年龄的增加而下降，然而也有部分学者认为年龄对ADSC成软骨分化能力的影响不大[29]。目前，大多数研究的首选取材部位是皮下脂肪，如腹部和臀部等，也有取自大网膜，不同部位来源的ADSC成软骨分化能力也有所差异[30]。在低氧条件下可以诱导细胞因子稳定表达，从而促进软骨相关基因表达，抑制YAP表达的同时不影响HIF-1α信号通路的表达，但会抑制由低氧引起的SOX9表达的上调。HIF-1α/YAP信号轴可能在促进软骨细胞分化和维持软骨细胞的表型中起重要作用[31]。有文献报告体外传代数在2～5代比较合适，此时细胞增殖、分化能力较强[32]。此外，诱导ADSC成软骨分化的过程中可能还受生物力学、动态环境和电磁场刺激等因素的影响[33]。

3 小结与展望

ADSC作为种子细胞用于软骨组织工程修复相应的软骨缺损已取得初步成功，但目前的研究还处于动物实验阶段，无论是体外研究还是体内研究仍存在许多问题有待解决。首先，ADSC的分离、提取和纯化缺乏标准化流程；其次，生长因子通过何种具体方式调节ADSC的作用机制目前仍不清楚；再者，天然支架和人工合成材料都存在一定的不足，如何将天然支架和人工合成材料结合起来，取长补短，实现最优组合还有待进一步研究。随着临床医学、细胞生物学、组织工程学和相关学科的发展，以及研究者对ADSC研究的不断深入和相关问题的不断解决，ADSC作为优良的种子细胞应用于软骨组织工程修复关节软骨缺损可能是一种理想、有效的治疗方法。