伍锡栋 林引花 徐丽瑛 朱思睿 孙英朔

1 江西省医疗器械检测中心检测四室 （江西 南昌 330000）

2 南昌大学药学院 （江西 南昌 330000）

内容提要： 目的：对聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）材质医疗器械的浸提液制备方法进行探索，为其细胞毒性检测提供依据。方法：按照GB/T16886.12中规定的浸提比例（0.2g/mL），改变浸提温度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）、时间（2h、4h、8h、12h、24h、48h）、湿度（100%、90%、80%、70%）和摇床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min），通过体外细胞毒性检测方法评价PVC材质医疗器械不同的浸提液对细胞毒性的影响。结果：细胞毒性与浸提样品的时间、温度及摇床转速呈正相关性，其中38°C、48h及摇床转速8000r/min细胞毒性最高，均＜70%，按照GB/T16886.5-2017判定均具有细胞毒性；结论：PVC材质医疗器械的体外细胞毒性对样品浸提液制备过程中浸提时间和摇床速率要求严格，在制备浸提液时应该根据产品的临床使用情况合理选择浸提时间和摇床的速率。

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）是由氯乙烯单体在过氧化物等引发剂或者光热条件下聚合而成的高分子聚合物，是世界上最早实现工业化的合成树脂之一，具有加工方便、可消毒、柔软、耐压等优良特性，被广泛应用于日常生活。根据数据显示，2018年我国医用塑料市场消费中PVC的用量占比高达28%，以PVC为材料的医疗器械普遍使用，PVC材质的医疗器械因会与人体接触所以需要格外注意其生物安全性[1]。细胞毒性试验是一种在体外借助相关的细胞，模拟细胞生长环境，具有广泛的通用性，在医疗器械的生物学评价中作为常规评价方法之一，是对医疗器械生物学评价的重要指标之一。GB/T16886.12针对样品浸提液制备方法比较统笼，然市场上PVC材料来源质量参差不齐，且加工过程中常添加增塑剂等物质，加工的产品状态及形状等均可能影响其浸出物的不同，直接影响产品细胞毒性等生物学的评价，本文针对PVC材质的医疗器械在制备浸提液时可能的影响因素进行比较探究，为此类材质的医疗器械产品的浸提液制备方法提供依据。

1.材料与方法

1.1 一般材料

细胞与试剂：L929细胞（来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）；MEM培养基（Gibco公司，批号：2085588）；胎牛血清（Excell公司，批号2261480CP）；0.25%胰蛋白酶EDTA消化液（Solarbio公司，批号：20210717）；100×青链霉素混合液（Solarbio公司，批号：20210625）等。

仪器设备：恒温培养摇床（KYC-1102C），二氧化碳培养箱（CLM-170B-8-NF），倒置生物显微镜（AE31），电子天平（JY2003），自动细胞计数仪（IC1000），压力蒸汽灭菌器（DSX-280KB24），全自动酶标仪（ELx800）等。

1.2 方法

1.2.1 浸提液制备

无菌条件下制备供试品浸提液，浸提比例为0.2g/mL，改变浸提温度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）、时间（2h、4h、8h、12h、24h、48h）、湿度（100%、90%、80%、70%）和摇床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min），浸提液为含10%胎牛血清的MEM培养液。阴性对照为高密度聚乙烯浸提液，阳性对照为10%二甲基亚砜（DMSO）培养液，置于振幅为100r/mim恒温震荡箱中24h[2,3]。

1.2.2 细胞形态观察

24h后，弃去加入96孔板中细胞孔的原培养液，加入空白对照液、阴性对照液、阳性对照液及供试液，置CO2培养箱继续培养24h，于生物学显微镜下观察细胞形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和细胞膜完整性等方面的改变。

1.2.3 MTT细胞毒性检测

弃去培养液，每孔加入50µL 1mg/mL的MTT溶液，37°C孵育2h后弃去所有孔内液体，加入0.1mL异丙醇，置振荡器上振荡10min，在酶标仪上双波长（570nm）测定吸光度，计算细胞存活率（%）=OD570e/OD570b×100（OD570e试样样品浸提液光密度平均值；OD570b空白液光密度平均值）。

2.结果

2.1 改变浸提液制备的湿度

在不同湿度（100%、90%、80%、70%）制备试验液，试验液接触24h后观察细胞形态、空泡、溶解等情况，并MTT法检测其OD值，计算细胞存活率，结果见图1和表1。

2.2 改变浸提液制备的温度

在不同温度（36°C、36.5°C、37°C、38°C）制备试验液，试验液接触24h后观察细胞形态、空泡、溶解等情况，并MTT法检测其OD值，计算细胞存活率，结果见图2和表2。

2.3 改变浸提液制备的时间

在不同时间（2h、4h、8h、12h、24h、48h）制备试验液，试验液接触24h后观察细胞形态、空泡、溶解等情况，并MTT法检测其OD值，计算细胞存活率，结果见图3和表3。

2.4 改变浸提液制备的摇床速率

在不同摇床速率（5000r/min、8000r/min、10000r/min）下制备试验液，试液液接触24h后观察细胞形态、空泡、溶解等情况，并MTT法检测其OD值，计算细胞存活率，结果见图4和表4。

3.讨论

聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）材质的医疗器械对接触的药品影响非常巨大，不仅会改变药品的成分，而且还会加快药物的聚合反应，影响人体健康，甚至影响到人生命。国家药品监督管理局国家药品包装容器（材料）标准YBB00012003中关于细胞毒性检查法的供试液制备要求用玻璃器皿作为浸提容器[4,5]；中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布的国家标准GB/T16886.5中体外细胞毒性实验的浸提条件要求在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，ISO10993中体外细胞毒性测试中浸提条件要求尽量模拟临床使用条件，应在无菌、化学惰性的封闭容器中进行[6,7]。然而PVC因为性能稳定、价格低廉而广泛应用于医疗器械领域，企业生产PVC材质的产品需要根据使用的需求不同而加入不同比例的增塑剂、热稳定剂、色素等添加剂，但是因为添加剂的使用会造成一定的生物毒性，对人体健康造成危害，在PVC材料加工时增塑剂和热稳定剂的使用量最大。细胞毒性研究是医疗器械生物学评价经典的试验方法，其干扰和影响因素复杂，类似上述列举的添加剂极其常见，故会给产品的生物性能带来一定的不可控的风险点，其中，产品的使用温度要求等都会影响产品的实际生物学性能等，故对其在生物学评价的细胞毒性浸提液制备中可能影响的因素有必要深入的研究。

本项目从通过体外细胞毒性检测方法评价PVC材质医疗器械不同的浸提液对细胞毒性的影响，对浸提样品浸出物可能影响的因素进行深入的研究比较，得出浸提时间、浸提温度、摇床转速等都会对细胞毒性的检测产生不同的影响，浸提时间越长、浸提温度越高及摇床转速越高，细胞毒性越大，提示可能跟样品浸提溶出物浓度有关，也可能材料中确实存在一些不确定的物质等，此实验结果将为企业有关生产工艺改进提供试验基础，同时为此类产品的检验检测提供实验依据，在实际检验检测中应该根据产品的实际使用情况选择不同的浸提条件，才能比较客观地反映产品的生物学毒性等。