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矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对H9c2心肌细胞衰老影响

2022-11-16周宏稷田惠张蕊常晓天安毅

青岛大学学报(医学版) 2022年5期
关键词:糖酵解心肌细胞试剂盒

周宏稷 田惠 张蕊 常晓天 安毅

[摘要] 目的 探討矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)对H9c2细胞衰老的影响及其机制。

方法 应用D-gal构建H9c2心肌细胞衰老模型,并筛选出C3G最佳干预浓度。将正常H9c2心肌细胞分为正常对照组(应用PBS处理48 h)、D-gal处理组(应用10 g/L浓度D-gal处理48 h)、C3G处理组(应用1 000 μmol/L浓度C3G处理48 h)、C3G+D-gal组(应用1 000 μmol/L浓度C3G与10 g/L浓度D-gal共同处理48 h)。检测各组细胞增殖活性、细胞凋亡水平、细胞内活性氧(ROS)水平;应用SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒测定SA-β-gal表达,应用实时荧光定量PCR方法检测CD38、Sirtuin 6(Sirt6)、己糖激酶(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和端粒酶逆转录酶(TERT)的mRNA表达,WST-8方法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的表达。

结果 使用10 g/L D-gal诱导H9c2心肌细胞48 h成功构建衰老心肌细胞模型,并筛选出C3G的最佳干预浓度为1 000 μmol/L。应用1 000 μmol/L浓度C3G进行干预,结果显示C3G可以抑制D-gal所诱导的衰老心肌细胞增殖水平降低(F=189.50,P<0.01)、凋亡水平升高(F=73.12,P<0.01)、细胞内ROS水平升高(F=106.00,P<0.01)以及SA-β-gal阳性细胞升高,降低D-gal诱导的衰老心肌细胞CD38、LDHA、HK2 mRNA 表达(F=23.14~94.00,P<0.01),同时升高TERT、Sirt6 mRNA表达(F=43.24、86.81,P<0.01)及NAD+的水平(F=77.02,P<0.01)。

结论 C3G通过抑制CD38的表达和提高Sirt6的表达,干预心肌细胞凋亡和增殖及糖酵解酶的变化,影响ROS的产生,从而发挥减轻心肌细胞衰老损伤的作用。

[关键词] 细胞衰老;矢车菊素-3-O-葡萄糖苷;CD38;Sirtuin 6

[中图分类号] R329.25;R916.4

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532(2022)05-0708-06

doi:10.11712/jms.2096-5532.2022.58.161

[开放科学(资源服务)标识码(OSID)]

[网络出版] https://kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20221021.1423.012.html;2022-10-24 09:08:57

EFFECT OF CYANIDIN-3-O-GLUCOSIDE ON SENESCENCE OF H9C2 CARDIOMYOCYTES

ZHOU Hongji, TIAN Hui, ZHANG Rui, CHANG Xiaotian, AN Yi

(Department of Cardiology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of cyanidin-3-O-glucoside (C3G) on H9c2 cell senescence and its mechanism.

Methods D-gal was used to establish a model of H9c2 cardiomyocyte senescence, and the optimal concentration of C3G was determined. Normal H9c2 cardiomyocytes were divided into normal control group (PBS treatment for 48 h), D-gal treatment group (10 g/L D-gal treatment for 48 h), C3G treatment group (1 000 μmol/L C3G treatment for 48 h), and C3G+D-gal group (co-treatment with 1 000 μmol/L C3G and 10 g/L D-gal for 48 h). Cell proliferation, cell apoptosis level, and intracellular reactive oxygen species (ROS) level were measured for each group; the SA-β-galactosidase (SA-β-gal) staining kit was used to measure the expression of SA-β-gal; quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of CD38, Sirtuin 6 (Sirt6), he-xokinase (HK2), lactic acid dehydrogenase A (LDHA), and telomerase reverse transcriptase (TERT); WST-8 assay was used to measure the expression of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+).

Results H9c2 cardiomyocytes were induced by 10 g/L D-gal for 48 h to successfully establish a model of cardiomyocyte senescence, and the optimal concentration of C3G was determined as 1 000 μmol/L. After intervention with 1 000 μmol/L C3G, the results showed that C3G inhibited the reduction in cell proliferation (F=189.50,P<0.01), the increase in cell apoptosis level (F=73.12,P<0.01), the increase in intracellular ROS level (F=106.00,P<0.01), and the increase in the proportion of SA-β-gal-positive cells induced by D-gal in senescent cardiomyocytes, and it also reduced the mRNA expression of CD38, LDHA, and HK2 (F=23.14-94.00,P<0.01) and increased the mRNA expression of TERT and Sirt6 (F=43.24,86.81;P<0.01) and the level of NAD+ (F=77.02,P<0.01) in D-gal-induced senescent cardiomyocytes.

Conclusion C3G can alleviate the senescence of cardiomyocytes by inhibiting the expression of CD38, upregulating the expression of Sirt6, intervening against the apoptosis and proli-feration of cardiomyocytes and the change in glycolytic enzyme, and affecting the production of ROS.

[KEY WORDS] cell senescence; cyanidin 3-O-glucoside; CD38; Sirtuin 6

细胞衰老和机体衰老存在因果关系,组织器官内衰老细胞聚集将影响机体正常的生物功能。因D-半乳糖(D-gal)致衰老模型构建简便,有较高可行性与稳定性,被广泛应用于基础实验中。矢车菊素-3-O-葡萄糖(C3G)为普遍存在于自然界中的一种稳定的花青素,具有抗氧化、抗炎等作用,对于延缓衰老具有重要意义。但其是否能干预心肌衰老进程及机制犹未明确。研究发现C3G具有CD38抑制剂的作用,而CD38的表达与衰老存在相关性。CD38作为细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)主要的代谢酶,在与年龄相关的衰老伴随的NAD+衰退中起着核心作用。前期研究发现,NK细胞中CD38高表达抑制了Sirtuin 6(Sirt6)的表达。有研究显示,C3G参与影响Sirt6功能,Sirt6通过沃伯格效应干预糖酵解酶的变化与衰老进程相关。本研究拟采用C3G干预D-gal诱导的大鼠H9c2心肌细胞衰老模型,探讨C3G对心肌细胞衰老的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大鼠心肌细胞H9c2购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。C3G、D-gal(索莱宝,中国);CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(MCE,美国); DMEM高糖培养液、胎牛血清(普诺赛公司,中国);Annexin V-FITC / PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(Elabscience,中国);细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒(碧云天,中国);大鼠Sirt6、CD38、乳酸脱氢酶A(LDHA)、端粒酶逆转录酶(TERT)、己糖激酶Ⅱ(HK2)引物(生工,中国); 氧化型辅酶Ⅰ/还原型辅酶Ⅰ(NAD+/NADH)检测试剂盒(碧云天,中国);RNA iso Plus(Takara,日本);HiScript Ⅲ RT SuperMix、SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞,中国)。

1.2 D-gal与C3G最佳干预浓度筛选及实验分组

H9c2细胞在含有体积分数0.10胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L链霉素的DMEM培养液中,37 ℃、体积分数0.05 CO培养箱中培养12 h,待细胞贴壁后,分别用0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L浓度的D-gal处理48 h,应用CCK-8方法测定细胞增殖水平,筛选构建衰老模型D-gal的最佳浓度。应用CCK-8方法,检测10、50、100、500、1 000 μmol/L濃度C3G对D-gal处理后H9c2细胞与正常H9c2细胞增殖水平的影响,筛选出C3G的最佳干预浓度。将正常H9c2细胞分为正常对照组(A组)、D-gal处理组(B组)、C3G处理组(C组)、D-gal+C3G组(D组)。正常对照组:H9c2细胞加入PBS处理48 h;D-gal处理组:应用10 g/L D-gal处理H9c2细胞48 h;C3G处理组:应用1 000 μmol/L浓度C3G处理H9c2细胞48 h;D-gal+C3G组:应用1 000 μmol/L浓度C3G与10 g/L浓度D-gal共同处理H9c2细胞48 h。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 细胞增殖活性检测 将未处理H9c2细胞悬液以每孔100 μL接种入96孔板内,按照1.2方法分组处理后,弃上清。重新加入含血清的DMEM高糖培养液,每孔内加入CCK-8试剂10 μL,37 ℃培养2 h。应用Infinite 200 Pro荧光酶标仪检测450 nm处吸光度值,以其表示细胞增殖水平。

1.3.2 细胞凋亡水平检测 将处理后的各组细胞用PBS洗涤,使用胰酶消化并离心,重悬于Anne-xin V Binding Buffer(1×)中。分别加入Annexin V-FITC Reagent与Propidium Iodide(PI) Staining Solution,避光孵育20 min。使用Apogee A50流式细胞仪(英国)分析细胞染色情况,以AnnexinV-FITC(+)/PI(+)、AnnexinV-FITC(+)/PI(-)细胞占比之和计为凋亡细胞总数。

1.3.3 SA-β-gal染色 使用SA-β-gal染色试剂盒测定SA-β-gal表达,按照试剂盒说明书进行操作。应用相差显微镜(100倍)观察各组细胞染色情况。衰老细胞表现为高表达SA-β-gal,SA-β-gal染色阳性细胞呈青蓝色,根据其比例判定细胞衰老状态。

1.3.4 细胞内ROS检测 应用 ROS检测试剂盒检测各组细胞ROS水平,按试剂盒说明书进行操作。使用荧光酶標仪检测ROS水平,激发波长为488 nm,发射波长为525 nm。

1.3.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测CD38、Sirt6、LDHA、HK2和TERT mRNA的表达 使用RNA iso Plus从H9c2细胞中提取总RNA,利用HiScript Ⅲ RT将提取的RNA逆转录为cDNA。将cDNA添加到ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix中,使用BIOER9660 FQD-96A荧光定量PCR仪(中国)检测CD38、Sirt6、LDHA、HK2和TERT mRNA表达,采用2方法计算结果。以β-actin mRNA作为内参。qPCR引物及其序列见表1。

1.3.6 WST-8法检测细胞NAD+的表达 应用NAD+/NADH检测试剂盒检测各组NADtotal及NADH的表达,根据说明书要求操作。荧光酶标仪检测450 nm处吸光度值,以NADtotal水平-NADH水平表示NAD+水平。

1.4 统计学分析

应用SPSS 24.0 软件进行统计学处理,计量资料结果以±s表示,数据间比较采用单因素方差分析及两因素析因设计的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 构建H9c2心肌细胞衰老模型的D-gal最佳作用浓度

正常对照组及0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L浓度D-gal处理组H9c2细胞增殖水平分别为2.44±0.03、2.17±0.13、2.10±0.16、2.02±0.07、1.89±0.02、1.75±0.02。不同浓度D-gal处理组细胞增殖活性均较正常对照组降低,差异有统计学意义(F=21.64,P<0.01);D-gal浓度为10 g/L时细胞增殖活性最低,为D-gal构建衰老模型的最佳浓度。SA-β-gal染色结果显示,10 g/L浓度D-gal处理组的阳性细胞比例较正常对照组明显增多(图1)。

2.2 C3G对H9c2心肌细胞的最佳干预浓度

CCK-8检测显示,正常对照组及10、50、100、500、1 000 μmol/L C3G处理H9c2细胞的增殖活性分别为1.76±0.04、1.59±0.13、1.90±0.16、1.98±0.07、1.99±0.02、2.00±0.07,100、500、1 000 μmol/L浓度C3G处理组细胞增殖水平较正常对照组升高,差异有统计学意义(F=9.43,P<0.01),其中1 000 μmol/L浓度C3G处理组细胞增殖水平最高。正常对照组、D-gal处理组及10、50、100、500、1 000 μmol/L C3G处理心肌细胞衰老模型组H9c2细胞的增殖活性分别为2.44±0.03、1.75±0.02、1.82±0.31、1.82±0.08、2.28±0.22、2.34±0.04、2.49±0.04。100、500、1 000 μmol/L C3G处理心肌细胞衰老模型组细胞增殖水平较D-gal处理组升高,差异有统计学意义(F=14.05,P<0.01),其中1 000 μmol/L浓度C3G处理组细胞增殖水平最高。

2.3 C3G对D-gal处理的H9c2细胞增殖、凋亡以及SA-β-gal染色的影响

在C3G未干预的情况下,D-gal处理组相较于D-gal未处理组细胞的增殖水平明显降低(F=265.85,P<0.01),凋亡水平明显增高(F=108.465,P<0.01);在C3G干预情况下,D-gal处理组相较于D-gal未处理组细胞增殖水平明显降低(F=53.11,P<0.01),而凋亡水平明显增高(F=20.43,P<0.05)。在D-gal未干预情况下,C3G处理组相较于C3G未处理组细胞增殖活性升高(F=22.55,P<0.01),凋亡水平降低(F=7.06,P<0.05);而在D-gal干预的情况下,C3G处理组相较于C3G未处理组细胞增殖活性增高(F=189.50,P<0.01),凋亡水平降低(F=73.12,P<0.01)。见表2、图2。SA-β-gal染色结果显示,与正常对照组比较,D-gal处理组阳性细胞比例显著升高;与D-gal处理组比较,C3G处理组阳性细胞比例显著降低(图3)。

2.4 D-gal及C3G处理对细胞糖酵解酶、ROS以及衰老相关蛋白酶TERT变化的影响在C3G未干预的情况下,D-gal处理组相较于D-gal未处理组LDHA、HK2 mRNA表达及ROS水平明显增高(F=31.71~69.00,P<0.01),TERT mRNA表达降低(F=38.37,P<0.01);在C3G干预的情况下,D-gal处理组相较于D-gal未处理组LDHA、HK2 mRNA表达明显增高(F=11.67、83.53,P<0.05),TERT mRNA表达水平明显降低(F=507.91,P<0.01),而ROS水平无明显差异(F=1.55,P>0.05)。在D-gal未干预情况下,C3G处理组相较于C3G未处理组细胞LDHA mRNA表达(F=12.37,P<0.01)、HK2 mRNA表达(F=69.20,P<0.01)及ROS水平(F=10.46,P<0.05)明显降低,TERT mRNA表达水平明显升高(F=525.23,P<0.01)。而在D-gal干预情况下,C3G处理组相较于C3G未处理组细胞LDHA mRNA表达(F=50.11,P<0.01)、HK2 mRNA表达(F=23.14,P<0.01)以及ROS水平(F=106.00,P<0.01)明显降低,TERT mRNA水平明显升高(F=43.24,P<0.01)。见表3。

2.5 D-gal和C3G处理对CD38、Sirt6 mRNA表达以及NAD+水平的影響

在C3G未干预的情况下,D-gal处理组相较于D-gal未处理组CD38 mRNA表达明显增高(F=94.00,P<0.01),Sirt6 mRNA表达(F=185.30,P<0.01)及细胞内NAD+的水平(F=112.20,P<0.01)明显减低;在C3G干预的情况下,D-gal处理组相较于D-gal未处理组CD38 mRNA表达明显增高(F=15.58,P<0.01),Sirt6 mRNA表达(F=289.16,P<0.01)及细胞内NAD+的水平(F=52.40,P<0.01)明显减低。在D-gal未干预情况下,C3G处理组细胞相较于C3G未处理组细胞CD38 mRNA表达水平降低(F=19.50,P<0.01),Sirt6 mRNA表达(F=161.52,P<0.01)及细胞内NAD+水平(F=29.41,P<0.01)升高;而在D-gal干预情况下,C3G处理组相较于C3G未处理组细胞CD38 mRNA的表达水平降低(F=103.33,P<0.01),Sirt6 mRNA表达及细胞内NAD+的水平升高(F=86.81、77.02,P<0.01)。见表4。

3 讨 论

衰老是机体和细胞水平上由多因素调节所导致的自然进程。细胞增殖与凋亡作为相互对应两方面,与衰老有着不可分割的联系。NAD+作为生命体的必要成分,随着年龄增加其水平逐渐降低,其涉及衰老的多种分子机制,如氧化应激与DNA损伤等;其也作为糖酵解的重要中间代谢产物维持糖酵解通量。CD38作为负责催化NAD+代谢酶,可能是NAD+水平随着年龄的增长而下降的主要原因。通过抑制CD38可逆转动物衰老及年龄升高所导致的组织内NAD+水平的下降,CD38并被认为是延长寿命的药理靶点。花青素是植物中的天然色素,对人体有着重要的营养及保护价值;C3G是桑椹花青素内的最主要与常见的成分之一,其对个体寿命影响的研究较多。包括C3G在内的花青素作为CD38的抑制剂,通过消耗NAD+,阻止CD38催化环腺苷二磷酸核糖的合成发挥作用。Sirt6自发现以来被冠以“长寿基因”的称号,也是长寿物种中有效的DNA双链断裂修复的关键基因。糖酵解为糖类物质的主要代谢方式,参与多种细胞衰老机制的调控。糖酵解酶HK2与LDHA的表达,不仅受Sirt6的抑制还与衰老相关。自由基衰老学说的核心内容是细胞氧化应激导致ROS过度生成及消除能力降低所引起的平衡性破坏,ROS表达与糖酵解酶LDHA和HK2都有着密切联系。同时ROS的过度聚集会导致端粒的损伤,而TERT可起到维持端粒稳定性的作用。TERT作为衰老相关蛋白酶,可反映细胞内端粒的状态,TERT表达水平与DNA的消耗和细胞衰老及DNA损伤有着重要联系。TERT不仅可以作为判定衰老水平的工具,也可以作为衰老机制探讨的靶点。

本研究通过检测细胞增殖活性水平,筛选出10 g/L浓度D-gal与1 000 μmol/L浓度C3G作为构建H9c2心肌细胞衰老模型以及C3G干预的最适浓度;应用D-gal处理后,衰老细胞增殖水平减低,凋亡水平增加;而C3G可以有效逆转衰老细胞增殖水平的降低、凋亡水平的增高;C3G能抑制正常细胞凋亡,促进其增殖;而且C3G能降低衰老心肌细胞SA-β-gal高表达细胞比例和ROS水平,升高TERT mRNA表达。提示C3G能减轻D-gal所诱导的心肌细胞衰老损伤。

本文对C3G干预衰老进程机制研究结果显示,衰老的H9c2细胞CD38 mRNA表达升高,Sirt6 mRNA表达及NAD+含量降低,C3G干预后可减轻这种衰老的变化;C3G干预可以降低正常细胞CD38 mRNA的表达,增加Sirt6 mRNA的表达及NAD+的水平。提示C3G可以通过干预CD38与Sirt6的表达进而影响D-gal构建的细胞模型衰老的发生与发展,且C3G作为CD38的抑制剂可以参与影响Sirt6的表达。C3G会降低正常细胞与衰老心肌细胞内LADH与HK2 mRNA的表达,提示C3G可通过影响Sirt6干预糖酵解进程最终参与衰老进程。

综上所述,D-gal通过影响CD38和Sirt6的表达以及NAD+水平干预衰老进程。Sirt6可通过沃伯格效应干预HK2及LDHA的表达进而影响细胞衰老的糖代谢水平。C3G可降低CD38的表达,升高NAD+水平,进而升高Sirt6表达而干预衰老进程中糖酵解酶的变化,减轻ROS所诱发的氧化应激损伤,发挥减轻D-gal所致心肌细胞衰老损伤的作用。

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(本文编辑 黄建乡)

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