陈柳宏，赵春雷，王 希，李彦丽,4，丁广洲，陈 丽

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080；2黑龙江省甜菜工程技术研究中心，哈尔滨 150080；3国家糖料改良中心，哈尔滨 150080；4国家甜菜种质中期库，哈尔滨 150080）

0 引言

转录组广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA 及非编码RNA；狭义上指所有mRNA 的集合[1]。转录组测序(RNA-seq)就是利用高通量测序技术将细胞或组织中全部或部分mRNA、smallRNA 和nocodingRNA进行测序分析的技术[2]。

基本上，单个生物体内的所有细胞都具有近乎相同的基因型，在基因的核苷酸序列不产生变化的情况下，基因表达的可遗传变化成为一种突破口。多细胞生物中不同细胞类型和特定细胞功能的产生很大程度上是基因差异性表达的结果。常规的转录组测序技术虽然能测序大部分的细胞，但所测结果实际上是一群细胞基因表达的平均值，忽略了细胞的异质性。此外，由于技术的局限性常导致RNA 纯化的效率以及检测的灵敏度不佳，在某些胚胎细胞的研究中还存在着可用前体细胞稀少等情况，在研究过程中进行转录组分析往往十分困难并在一定程度上无法收集到大量的细胞数据。因此，检查单个细胞的转录组是解释基因表达异质性和随机性必不可少的过程。

单细胞转录组测序(Single-cell RNA-seq,scRNAseq)的研究为理解不同细胞类型或单个细胞的的转录过程创造了可能性，目前已经广泛地被应用与医学与动物研究之中，如使用单细胞转录组测序技术对细胞谱系轨迹以及稀有细胞类型进行鉴定[3]，并在疾病研究与动物胚胎发育中取得了可观的进展[4-5]。高通量单细胞转录组测序技术可以识别和表征来自组织或器官中的大量细胞群体中的稀有细胞类型，目前在拟南芥中发现其基因型之间的表达差异性很大[6]，利用大量根表达标记基因能够完成罕见细胞类型（如QC细胞）的鉴定。因此，深入理解单细胞转录组测序技术可为研究细胞功能提供新的思路，有助于人类探索不同细胞类型在发育过程中的作用及细胞调控网络[7]。

1 单细胞转录组测序及其发展概况

1.1 单细胞转录组测序技术

细胞是生物体的基本结构和功能单位。每一个生命体都是从一个细胞生长发育而来，每个细胞都具有独特的表型和生物学功能。生物体中相同或者不同的组织、器官、系统中的细胞均存在异质性，细胞的异质性由其遗传物质所决定，其本质差异体现在基因组、转录组、表观组层面。因此，为了研究生物体的功能机制并避免样本均质化掩盖单细胞的异质性，单细胞转录组测序技术应运而生。单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)是指能够获得单个细胞内近万个基因表达信息，并且能够辨别生物组织中各种细胞类型的转录特征以及全面揭示细胞之间基因表达异质性的测序方法[8]。以目前应用广泛的10 X Genomics 单细胞转录组测序平台为例，该技术利用微流控、油滴包裹和baecode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500～10000 个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息，具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势。该技术主要用于细胞分型和标记因子的鉴定，从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测，此外该技术还可以预测细胞分化与研究发育轨迹，在当下疾病、免疫、肿瘤领域以及组织、器官、发育研究中发挥越来越重要的作用。

1.2 单细胞转录组测序发展概况

最早的单细胞转录组技术利用基于PCR 技术的对单个细胞cDNA 的指数扩增和线性扩增进行了探索，但仅局限于检测单个细胞中的少数基因[9]。2006年，Kurimoto 等[10-11]改进了单细胞cDNA 扩增方法，将定向的PCR 扩增与线性扩增相结合，结合芯片技术对单个胚胎干细胞进行了分析，在高覆盖率和准确性的前提下，使细胞和基因的通量有所提升。随着测序技术的发展，2009 年，Tang[12]首次创立基于高通量测序的单细胞RNA 测序分析并应用于单个小鼠的卵裂球，使基因检测通量大幅度提高，检测出比芯片技术更多的转录本。随后，CEL-Seq 技术的开发克服了单个细胞中由于少量起始RNA 导致的高通量测序受限，并应用于秀丽隐杆线虫胚胎姐妹细胞研究之中，成功观察到其姐妹细胞之间转录物的差异性分布[13]。类似采用线性扩增或拟线性扩增的技术如PMA[14](phi29- mRNA amplification)， SMA[14](semirandom primed PCR- based ,RNA transcriptome amplification)，哈佛大学谢晓亮院士发明的MALBAC[15](Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)，即多次退火环状循环扩增技术（可以对单个细胞、单条染色体或者0.5 pg 的RNA 进行高保真扩增）均在研究中使用以便保留完整的转录组信息，并已经进行商业化运作。在此基础上，单细胞转录组测序技术发展愈发成熟，2018 年，浙江大学医学院郭国骥团队自主研发出高通量测序平台Microwell-seq，并发表了世界首个小鼠细胞图谱[16]，且在2020 年成功绘制世界首个涵盖八大系统的人类细胞图谱[17]。

单细胞转录组测序技术最先运用于对胚胎早期发育、分化以及重编过程中起作用的动态基因的研究。Tang 等[18]利用该技术首次检测到胚胎发育过程中microRNA 的变化，揭示了体外囊胚期内细胞团向多能胚胎干细胞转变中的转录组重编过程。近期，Briggs 等[19]基于微流控技术对西部爪趾蛙进行单细胞转录组测序分析，推导出脊椎动物中细胞状态的详细变化情况，阐明了脊椎动物早期发育基因表达程序的保守性和发散性特征。除此之外，Treutlein 等[20]又将该技术运用于远端肺上皮谱系层次建立中，实现了其在组织器官发育中的运用。随着单细胞转录组测序技术的不断发展，之后又相继应用于在免疫细胞对于抗原的应答机制中的一致性分析[21]以及肿瘤细胞之间基因突变或表达图谱差异性的研究中[22]。在动物中的成功运用也为植物研究提供了新的思路，Mello等[23]在2015年对拟南芥采用流式技术进行单细胞转录组测序，并将拟南芥根尖细胞进行分类，成功完成了植物种单细胞水平标记基因的筛选。Shulse等[24]在2019 年对拟南芥根部细胞进行更深入的研究，涵盖几乎所有主要的根组织和发育阶段的细胞类型，证明了单细胞转录组测序可用于分析植物的发育过程，并展示了外部刺激导致的植物根细胞转录组变化。此外，单细胞转录组测序也被运用于植物保卫细胞功能分析中，以解释关键基因表达的作用机理[25]，并在玉米生殖细胞研究中解释了减数分裂失败情况下胚转录继续进行的原因[26]。综上所述，人们可以通过单细胞转录组测序技术对生命体在单个细胞层面上对其内部复杂的转录调控和表观遗传进行更深层次的分析，从而全面了解各类细胞以及其功能。

2 单细胞转录组测序技术要点

单细胞转录组测序的工作流程包括三个关键步骤：第一，单细胞的分离；第二，单细胞全转录组cDNA 扩增；第三，测序和初级分析；第四，数据可视化与解读。其中包含三个关键的技术要点[27]：单细胞分离技术、单细胞全转录组cDNA 扩增技术、高通量测序技术。下文将对三个关键的技术要点进行阐述。

2.1 单细胞分离技术

单细胞分离技术对提升细胞通量起到关键的作用。由于单个细胞体积微小并容易受到外界环境的影响，分离单细胞往往十分困难。分离方法从最初的人工手动分离逐步发展至自动化的集成流体电路、微流控技术等，实现了细胞通量的大幅度提升，这些方法各有利弊，应根据具体的研究内容进行适当的选用。此外，分离得到的单细胞需要进行隔离以保证其独有的微反应体制。

2.1.1 微流控技术 该技术具有基于流体动力穿梭的微流控芯片、微滤器以及微通道。由于单个细胞的细胞大小、物理结构都有所不同，可通过控制细胞的数量和密度实现高精度的单细胞捕获。微流控芯片中微米级的二维或三维通道为单个细胞的操纵提供了尺寸相匹配的结构。根据不同的研究需求，微流控芯片系统可以将多种单细胞研究所需的操作单元，如细胞操纵相关的微泵、微阀技术，单细胞捕获技术以及检测分析单元等设计并集成到微小的芯片平台上。此外，这些物理结构也会影响细胞培养和动态活细胞的成像能力。微流体几何捕集系统通过对细胞特征信息进行成像来分离目标单细胞，有助于阐明细胞的异质性[28]。目前微流控技术已经进行了商业化的运用。

2.1.2 稀释法 稀释法是得到单细胞的一种相对简单的途径，通过将细胞群体放入不同倍比梯度的细胞悬液中稀释，指导得到单个状态或者极少数量状态的细胞[29,30]。这种方法操作简单，但不易精确控制单个细胞，容易造成分离错误或者丢失。因此，稀释法可以与微流控技术相结合[31]，在微流控芯片的基础上，设计一系列复杂的梯度网络实现连续稀释，使最终被分离的细胞进入芯片通道内，更有效的控制单个细胞，该方法已经被用于检测抗菌药物敏感性等实验中[32]。

2.1.3 显微操作法 显微操作法是使用光学显微镜直接进行显微操作分选的方法，能成功地分理出单个细胞，但其不适用于大量样品的分离[33]。该方法易于操作并且能够对单细胞进行直观观察，但容易损伤细胞，造成识别错误。

2.1.4 荧光激活细胞分选法 荧光激活细胞分选法是将表面具有特定标记的靶细胞进行富集或简单分选的方法[34]。但在其分解流体过程中，容易造成细胞的损坏甚至导致mRNA 或DNA 的丢失。此外，使用此方法需要较大的样品量[35]。

2.1.5 光学镊子法 光学镊子法是显微操作中的一种方法[36]，通过高度聚焦的激光束夹取细胞。其缺点是不能直接接触细胞，因为其对细胞产生的光损伤和热损伤是无法避免的[37]。

2.1.6 集成流体电路法 集成流体电路法通过与微流控芯片技术相结合，可以设计出集成单细胞捕获的介电泳连续分离微流控芯片,并利用介电泳原理，对外部施加非均匀电场，使细胞受到的不同大小或方向的介电泳力而实现细胞分离,利用微捕获结构来捕获单细胞[38]。该方法具有高通量、低成本等优点，已经被广泛应用于细胞捕获和排列[39]、细胞聚焦[40]等领域中。

2.2 单细胞全转录组cDNA扩增技术

单细胞全转录组扩增是进行后续单细胞测序的前提，传统的扩增方法如引物延伸与扩增法，简并寡核苷酸引物PCR 技术对温度等条件要求较高，且扩增片段较短，变异系数高，容易造成非特异性扩增，导致扩增产物不均匀并出现扩增偏好性[41-42]。近年来，随着扩增技术的发展，多重置换扩增技术和多次退火环状循环扩增技术被广泛应用于全转录组cDNA 扩增中。

2.2.1 多重置换扩增技术 多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)是一种等温扩增方式，由Dean 于2002 年发明[43]。其对整个基因组覆盖广泛，并且在各个位点上产生的扩增偏移最小[44]，在全基因组扩增中应用广泛。该方法先由随机6 碱基引物在多个位点与模板DNA 进行复性，然后在phi29DNA 聚合酶的作用下在DNA 的多个位点同时开始复制；复制合成的DNA 取代模板的互补链，同时被置换的互补链又成为新的模板进行扩增[45]。该方法具有高通量和能获取高质量DNA 的优点，但MDA往往存在与模板无关的扩增。为了解决此问题，2017年，Wang 等[46]对MDA 进行改进，创造了仅以模板依赖为方式的等温扩增(template-dependent MDA,tdMDA)，通过5’端封闭的随机无聚体引物开展逆转录和MDA，以便消除与模板无关的扩增，并在人类循环RNA扩增中应用。

2.2.2 多次退火环状循环扩增技术 多次退火环状循环扩增技术(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)是谢晓亮等[42]在2012年发明全新的全基因组扩增方法。该方法引入了类似线性预扩增的方式以减少与非线性扩增相关的偏差，使用pg 级的DNA 片段作为扩增模板并使用随机引物进行扩增，引物由固定的27个核苷酸序列和8个可在0℃下与模板均匀结合的可变核苷酸组成；在温度升至65℃下，在具有链置换活性的DNA 聚合酶作用下产生长度不一(0.5 k～1.5 kb)的半扩增子；半扩增子在94℃下离开模板，并以其为模板扩增产生两端具有互补末端(27 nt)的完整扩增子。随后降温至58℃使完整扩增子环化，防止进一步的扩增和交叉杂交，因此可以在很大程度上保证其发生线性扩增。在经过线性扩增循环后，使用27 nt 通用引物对得到的大量的全扩增子进行指数PCR 反应，产生下一代测序所需的微克级别DNA。

MALBAC 扩增效率高，能实现全基因组覆盖并克服了PCR 放大过程中产生的偏差，并在辅助生殖[47]等领域发挥了重要的作用，为研究染色体疾病提供了工具。

2.3 高通量测序技术

高通量测序技术(High- throughput RNA Sequencing)是以Roche 公司的454 技术、lllumina 公司的Hi Seq 和Mi Seq 测序平台以及Solexa 技术为基础的测序技术。相对于传统的桑格测序而言，高通量测序技术能一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，能对绝大多数的转录表达进行精准地定量。其原理是酶级联化学发光反应，将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并在DNA 聚合酶、底物荧光素酶等酶的作用下共同孵育形成单分子簇；扩增达到测序所需模板量后加入带有特异荧光的碱基(dNTP)，每次只添加一个，通过其可逆止的特性，依次添加激发不同颜色的荧光基团，转化得到结果，最终完成测序[48]。

3 单细胞转录组测序技术在植物研究中的应用

3.1 植物单细胞转录组测序技术

单细胞转录组测序技术目前已被生物学与医学领域广泛应用，由于植物细胞存在细胞壁，进行单细胞测序存在一定的难度，但其在植物研究中存在着巨大的潜力。不同的scRNA-seq 技术适用于不同的范围，多孔板法和液滴法是目前植物研究中应用最广泛的技术，可根据实验目的和植物样本类型选择合适的技术方法[49]。在样本量较少以及样本稀有的情况下，使用多孔板法；对于样本量高的实验，可采用微流控芯片，利用液滴分选单个细胞，该方法具有高通量的特性，可获得大量的细胞。

3.2 单细胞转录组测序在植物中的应用

3.2.1 研究基因表达模式和细胞功能区域特性 不同细胞内不同基因的表达影响着植物的生长与代谢，研究基因表达模式有助于判断调控植物体内反应的基因类型，以便对植物本身以及和外部环境之间的反应进行更好的研究与改良，提高了优化目的性状的靶向性与可操作性。2008 年，Lieckfeldt 等[50]对拟南芥的基底细胞、表皮细胞和表皮毛细胞进行了研究，通过RT-PCR 将三类细胞的基因表达进行了分类，并从中定位参与代谢的基因。2015 年，华中农业大学严建兵团队实现了玉米单细胞转录组测序，通过对玉米四分体的每个小孢子进行测序，加深了对减数分裂的理解[51]。Ryu 等[52]在2019 年对超过10000 个拟南芥根细胞以液滴微流控技术为基础进行单细胞转录组测序，集中分析了单个细胞的发育轨迹，同时从根表皮突变体中获得单细胞转录组，对其基因表达进行比较分析，完成了拟南芥根的第一代基因表达图谱，为研究突变基因的影响提供了新的视角。

3.2.2 解释植物发育过程与生理特性 通过对细胞类型特异性表达差异的研究，能够解释新的细胞类型和细胞谱系的发育轨迹，2019 年，Jean-Baptiste 等[53]通过对拟南芥跟细胞的单细胞转录组进行分析排序，鉴定了数百种具有细胞异质性表达的基因；此外，对总RNA 表达在发育轨迹中的变化进行评估阐明了其发展方向；最后对拟南芥幼苗进行高温胁迫，研究了长期存在的对非生物胁迫响应中细胞异质性可能存在的影响，检测出除热休克基因主导跨细胞类型的表达外，其他基因之间也存在着细微但显著的差异，证明单细胞转录组学对植物发育与植物生理有着重要的研究意义。此外，Denyer 等[54]通过高通量单细胞转录组测序技术构建了拟南芥单细胞RNA 表达图谱，揭示了拟南芥发育中关键的发育调节因子和下游基因，这些基因决定了不同细胞独特的形状和功能，证明了单细胞转录组测序应用于植物的能力。

3.2.3 对植物细胞类型进行鉴定 基因的选择性表达导致细胞分化成不同的类型，不同类型的细胞具有其独特的功能。对植物细胞类型进行鉴定，有利于进一步研究各类别细胞对植物生命活动的影响。Zhang等[55]收获了拟南芥根组织细胞，并将其转化为原生质体进行单细胞转录组测序，将得到的数据进行线性维数缩减并得到100 个近似主成分，对其进行分析，成功将拟南芥根细胞分为24 个细胞簇；通过富集簇基因与已知的跟细胞类型和相关系数分析，进一步验证了每个簇的细胞类型。此外Ryu 等[52]也根据拟南芥细胞的原生质体测定了每个原生质体的转录组，通过聚类分析将10000 个拟南芥根细胞分成了九个簇并进行了细胞亚群和罕见的细胞类型鉴定。可见，单细胞转录组测序技术能有效地运用于细胞类型鉴定之中。

4 展望

单细胞转录组测序技术能够对植物的基因表达、发育过程以及细胞类型进行测序分析，是从细胞水平解释动植物生命活动的有效工具。但是，在植物研究中仍存在以下两点问题：（1）由于植物细胞存在细胞壁，目前在植物中进行的单细胞转录组测序仅能通过原生质体进行测序。（2）在植物基因表达模式的研究中常存在数据结果精度较低的情况。尽管如此，许多单细胞组学工具已经存在或正在开发中[56-57]，可以通过检测染色质的可及性[58]和映射细胞的基因组情况[59]来解决这些问题，同时使该技术能更好的运用于植物研究中并建立相关抗病机制遗传图谱，为理解植物细胞提供更好的技术支撑。