伍会琴,刘辉

癌症是危害人类健康的主要原因之一，已经发展成为全球性的公共卫生问题。宫颈癌是全球第四大常见的女性恶性肿瘤[1]，对女性健康构成严重威胁。在发展中国家，宫颈癌是导致女性癌症死亡的第二大原因[2]。因此，揭示宫颈癌的发病机制、寻找新的治疗靶点、探索宫颈癌特异性的生物标志物，俨然成为了当下最为迫切的问题。目前，巴氏涂片和病毒DNA分析等诊断方法以及人乳头瘤病毒 (human papilloma virus,HPV) 疫苗的应用，对于降低宫颈癌的发病率做出了巨大的贡献。然而，宫颈癌的治疗与诊断仍是巨大的挑战。

蛋白质组学以一个基因组、细胞或完整生物所包含的一整套蛋白质为研究对象，研究生物体内蛋白质的结构、功能，并对其进行定性定量分析。这一概念由Wilkins等[3]在1995年提出，被认为是后基因组时代的关键技术之一。近年来，蛋白质组学技术逐渐成为解决有关医学或分子生物学研究等问题的强有力工具，已经广泛地应用于对宫颈癌的研究中，尤其是在宫颈癌相关生物标志物的筛选中，发挥着不可替代的作用[2,4]。同时，也为探索宫颈癌的发病机制及靶向药物的研究提供了新的方法与途径。本文概括并总结了蛋白质组学及其相关技术在宫颈癌研究中的应用与进展，对其涉及到的分析技术和方法进行汇总，旨在为宫颈癌的诊断及治疗提供参考。

1 定量蛋白质组学技术

1.1 二维凝胶电脉

二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)由Smithies和Poulik[5]在1956年提出。它是基于两种电泳过程的集合，借助梯度pH胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)完成对蛋白质的双向分离，从而在蛋白质混合物的分离中获得更高的分辨率[5]。2-DE的凝胶根据蛋白质在分子量以及等电点上的差异分离蛋白质，在单次实验中即可实现对4 000～5 000种蛋白质的分离，从而实现大规模的蛋白质分析[6-7]。该技术的主要优势在于促进蛋白质图谱的可视化，这有助于和其他蛋白质图谱直接进行比较。

使用2-DE的蛋白质组学研究已经应用于分析宫颈癌等恶性肿瘤。Guo等[8]采用2-DE联合基质辅助激光解析/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS)的方法筛选鳞状宫颈癌(squamous cervical cancer，SCC)的化疗敏感性生物标志物，发现Hsp70可能是预测鳞状宫颈癌患者化疗疗效的潜在生物标志物。Jin等[9]使用蛋白质组学方法与2-DE结合质谱法探索Mycoepoxydiene(MED)的细胞靶标并分析MED在HeLa细胞中的抗肿瘤活性分子机制，发现MED可以显著下调糖酵解和磷酸戊糖途径中丙糖磷酸异构酶 (triose phosphate isomerase，TPI) 和 6-磷酸葡萄糖酸内酯酶 (6-phosphogluconolactonase，PGLS)的表达水平，进而抑制糖酵解和磷酸戊糖途径，并抑制HeLa细胞的生长。二维差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE)是2-DE的一种改进形式。与传统的2-DE相比，基于2D-DIGE的定量蛋白质组学利用荧光染料(Cy3和Cy5)对蛋白质样品进行预标记，具有更高的灵敏度、准确度和重现性等优势。Serafín-Higuera等[10]使用2D-DIGE分析了正常宫颈细胞和感染HPV16的宫颈癌细胞之间的差异蛋白，与正常的宫颈细胞相比，感染了HPV16的宫颈癌细胞中，Mimecan、主动脉平滑肌肌动蛋白和 Lumican的表达水平增加，角蛋白、II 型细胞骨架 5、Peroxiredoxin-1和14-3-3蛋白 sigma的表达水平下降，这些蛋白可以作为识别宫颈癌的生物标志物。

1.2 非标记定量蛋白质组学技术

非标记定量蛋白质组学技术(label-free quantitative proteomics，LFQP)主要应用于对蛋白质的肽段进行定量分析。肽段的定量是基于对不同生物样品中提取的肽段质谱峰强度的比较(基于强度的定量)，或者基于对同一肽段获得的串联质谱检测次数(光谱计数方法)来代表肽段在混合物中的相对丰度，可以在复杂样本中实现对目的蛋白的鉴定与分析，适用于大规模的生物样品研究。同时，其凭借低成本、样本制备简单等特点，广泛应用于对蛋白质及生物标志物的筛选。

Hao等[11]采用非标记定量蛋白质组学技术分析了来自C-33A、Caski和SiHa 宫颈癌细胞系的分泌蛋白，并使用酶联免疫吸附试验(ELISA)和液相色谱平行反应监测/质谱(liquid chromatography parallel reaction monitoring/mass spectrometry， LC-PRM/MS)等进行了相对与绝对定量验证，结果显示FBLN1和ANT3可以作为宫颈癌和HPV感染的血清蛋白标志物，也为相关ELISA试剂盒的开发提供参考。此外，非标记定量蛋白质组学技术也适用于宫颈癌相关蛋白翻译后修饰的分析。Zhang等[12]对3例宫颈鳞状细胞癌患者的原发癌组织和相应的邻近正常组织进行了基于质谱(MS)的定量乙酰蛋白质组学分析，并采用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)及蛋白质印迹(western blot，WB)方法进行验证，以探讨蛋白质的乙酰化在宫颈癌发生过程中的作用。研究发现与邻近的正常组织相比，宫颈癌组织中的CREBBP和p300 被上乙酰化，说明了组蛋白乙酰化在宫颈癌进程中发挥着重要作用。近年来，由于生物信息学分析技术的不断发展，基于非标记定量的蛋白质组学技术也经常和生物信息学分析结合起来，实现对宫颈癌相关蛋白以及生物标志物的筛选。Starodubtseva等[13]基于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法对宫颈肿瘤转化不同阶段的宫颈阴道液(cervicovaginal fluid，CVF)蛋白质组进行筛选，通过绘制Venn图、热图、火山图等生物信息学分析手段，对筛选出的蛋白进行分析，并借助PLS-DA方法建立统计模型，对获得的CVF蛋白质组学数据进行分析，该模型的敏感性为77%，特异性为94%，证明了CVF蛋白质组可以用来反映宫颈上皮肿瘤的进程。

1.3 标记定量蛋白质组学技术

标记定量蛋白质组学技术(labeled quantitative proteomics，LQP) 通过使用稳定同位素对蛋白质或肽段进行标记并实现蛋白质定量。经过稳定同位素标记后的蛋白质或肽段与原来相比，除了在质量上有差异，其基本的化学性质并没有发生改变，通过识别肽段的质量差，从而实现对目的肽段及目的蛋白的筛选及定量。标记定量根据标记方式的不同，可以分为体内标记和体外标记，体外标记又分为化学标记和酶促标记。

细胞培养稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)是一种在蛋白质合成过程中将含有“轻”或“重”同位素标记的氨基酸(精氨酸或赖氨酸)掺入到细胞蛋白质组中，从而实现对全细胞蛋白质进行标记的一种高通量定量蛋白质组学技术，由Ong等[14]在2002年提出。该技术自面世以来，受到广泛关注。该技术的主要优势在于含有同位素标记的氨基酸掺入后，差异标记的样品在细胞裂解后立即与之混合，可以最大限度地减少处理样品所造成的定量误差[15]。于此同时，SILAC是一种简单、廉价且准确的手段，可用作任何细胞培养系统中的定量蛋白质组学研究，是研究蛋白质表达、细胞信号转导和蛋白质翻译后修饰的重要技术[16]。Zhang等[16]采用SILAC的方法评估了Zeylenone (Zey)诱导的HeLa细胞蛋白质组的变化，结合质谱分析并采用qPCR进一步验证，发现Zey通过影响Bcl-2和14-3-3蛋白家族之间的相互作用以及对HSP70和RP家族蛋白的抑制来诱导HeLa细胞凋亡，该研究对于发现宫颈癌潜在的抗癌靶标具有重要意义。Yang等[17]使用表达人乳头瘤病毒(HPV16)的永生化人角质形成细胞,通过向培养的人角质形成细胞(正常口腔角质形成细胞，NOKs)培养基中加入了标记的精氨酸与赖氨酸，以评估癌基因表达对宿主细胞的影响。借助RNA-Seq分析以及生物信息学分析等方法验证了先前研究中已被证明受HPV影响的基因，包括上调基因IL1A、UCHL1、TYMS、EGFR、TP63和PCNA以及下调基因STAT1、FN1和ISG15。对于在SILAC技术中存在的精氨酸转化为脯氨酸的问题，在Taga等[18]的研究中，通过向培养基中添加200～300 mg/L的脯氨酸即可有效抑制这种转化并降低实验误差。同时，Super-SILAC 技术[19]的应用，也打破了SILAC只能应用于活细胞研究的限制，为SILAC技术的发展与应用开拓了新的方向。

同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)由Ross等[20]在2004年提出，这是一种基于串联质谱的多重蛋白标记技术。利用多种iTRAQ试剂标记肽段氨基末端或赖氨酸侧链基团，并使用串联质谱进行分析，最多可同时对八组样品的蛋白进行定量分析和比较，是一种具有高通量、高稳定性和广泛适用性的分析方法。与非标记定量蛋白质组学技术相比，该技术在统计学分析以及定量分析上具有更加明显的优势[21]。串联质谱标签法(tandem mass tag，TMT)与iTRAQ原理类似，由Thompson等[22]提出，采用等压标记的方法对胰蛋白酶消化的肽段进行化学标记，该化学标签会产生不同的报告离子(报告基团、平衡基团、反应基团)，不同的报告离子会表现出不同样式的质谱峰，对比质谱峰的信号强度和峰面积，即可得出同一肽段在不同样品之间的含量。

迄今为止，使用化学标记法(例如iTRAQ和TMT)进行同位素标记的技术已经广泛应用于蛋白质组学研究，通过使用化学标记法成功地发现了许多潜在的癌症生物标志物以及治疗靶标。为研究宫颈癌组织中蛋白质组学的复杂性并寻找疾病相关的生物标志物和治疗靶点提供了有效的方法。

He等[23]对正常的SiHa细胞和用紫杉醇(Paclitaxel)和卡铂(Carboplatin)处理14 d的SiHa细胞进行了基于iTRAQ技术的定量蛋白质组学分析，探讨抗肿瘤药物耐药机制的相关蛋白，GO和KEGG分析用于识别相关过程和差异表达的蛋白质。与对照细胞相比，APOA1在抗紫杉醇和卡铂处理的SiHa细胞中均过表达。免疫组织化学结果显示APOA1在紫杉醇和卡铂耐药的宫颈鳞状细胞癌中高度表达。因此，APOA1蛋白可以作为监测和预测紫杉醇和卡铂耐药水平的潜在标志物，并且，iTRAQ技术是一种在蛋白质水平上研究影响耐药性因素的有效方法。Xia等[24]通过将平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)分析和 iTRAQ技术相结合，分析了Astragaloside IV (AS-IV) 处理的宫颈癌细胞中差异蛋白的表达和AS-IV抑制宫颈癌细胞侵袭的分子机制。实验结果表明，共有32种差异表达蛋白，其中16种表达增加，另外16种表达减少。经过GO与PPI分析，发现 AS-IV上调Atg12并通过DCP1A和TMSB4X诱导癌细胞自噬，抑制宫颈癌侵袭。其中DCP1A和TMSB4X在自噬过程中可作为AS-I的靶标，也可作为用于宫颈癌治疗的抗癌化合物筛选的靶标。同时，PRM与iTRAQ的组合可用于大分子目标化合物的鉴定，也可被视为筛选用于治疗宫颈癌的抗癌化合物的新技术。Han等[25]对正常宫颈组织(N)、高级鳞状上皮内病变组织(HSIL)和宫颈癌组织(CC)进行了基于iTRAQ技术的差异蛋白分析，在宫颈癌样本中鉴定了72 种差异表达的蛋白质，其中，以核酸结合蛋白为主。HMGB2蛋白在宫颈癌样本中呈现出明显的上调，且其上调与原发肿瘤大小、浸润深度和FIGO分期有关，并参与肿瘤的进展。最终结果表明，HMGB2可能促进宫颈癌的进展，宫颈癌组织中HMGB2的存在可能是宫颈癌疾病的生物标志物和预后指标。Grassett等[26]通过TMT分析了五氟苯基(pentafluorophenyl,PFP)作为高pH反相色谱(high pH reversed phase，Hi-pH RP)和强阳离子交换(strong cation exchange，SCX)的替代品，对在从人宫颈癌 (HeLa)细胞中分离的肽和磷酸肽进行预分馏的性能，结果显示，复杂肽和磷酸肽样品的离线PFP分馏减少了样品处理和处理时间，并降低样品复杂性。

同位素亲和标签技术(isotope-coded affinity tags，ICAT)由Gygi等[27]提出。通过使用生物素化的碘乙酰胺衍生物对蛋白质中的半胱氨酸巯基进行标记，并使用胰蛋白酶对蛋白质进行酶解。随后，采用亲和层析法将标记肽段与未标记肽段分离，最后进行质谱分析与鉴定[28]。该方法允许从复杂的样品混合物中分离含半胱氨酸的肽，从而大大减少引入质谱仪的肽段数量。Zhang等[29]使用氧化同位素编码亲和标签(oxidative isotope-coded affinity tags，OxICAT)分析HPV感染的宫颈癌细胞中蛋白质的整体氧化还原状态，以确定基因治疗的潜在目标。 研究发现电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel1，VDAC1)在HPV阳性宫颈癌细胞中被高度氧化，VDAC1与HPV16 E7相互作用促进宫颈癌发展。因此针对VDAC1的研究可能是治疗宫颈癌的潜在策略。

目前质谱定量技术主要采取数据依赖采集(data dependent analysis，DDA)和数据非依赖采集(data independent analysis，DIA)两种方法，传统的DDA在一次扫描循环中，对母离子碎裂产生的子离子进行分析，然而实际情况更倾向于选择肽段样品中的高丰度肽段，这会导致低丰度肽段的信息丢失。DIA的出现解决了这一问题，根据其分析原理，DIA可以将整个质谱分析扫描窗口分为若干个小窗口，在一次扫描循环中对所有母离子进行碎裂，并记录全部子离子的信息，并且不需要指定目标肽段且扫描点数均匀，利用谱图库即可完成定量离子筛选与确认，具备极佳的重复性[30]。DIA可以对所有离子碎片进行无差别的分析而不受限于目的肽段本身，适用于大规模的蛋白定量分析。如今基于DIA技术的SWATH(sequential window acquisition of all theoretical spectra)方法已被应用到宫颈癌的研究中。Shen等[31]使用SWATH-MS技术对miR-26a敲除的HeLa细胞中蛋白质表达变化进行了分析，并创建了HeLa细胞中miR-26a靶向转录物的清单。结果显示，NUF2、CDK6和USP47作为HeLa细胞中miR-26a的靶标。此外，首次发现 MYPN、DNAJC9和 PPA1 作为 mi-RNA 靶标，这6个基因的表达在miR-26a过表达系中均受到抑制。

2 定性蛋白质组学技术

鸟枪法(shotgun)是一种对蛋白质进行全谱分析的技术，其基本方法是先使用酶消化混合物中的蛋白质，然后通过液相色谱法(LC)分离得到肽段，并使用串联质谱法(MS/MS)鉴定肽段，在肽段水平实现对蛋白质的分析与鉴定，适用于各种蛋白质混合物，如血清、组织、各种体液以及尿液等，是一种高通量的蛋白质组学技术[32-33]。鸟枪法宏基因组DNA测序为了解各种生物的系统发育、生物多样性、代谢能力和功能多样性提供了有效的手段。Kwon等[34]采用鸟枪法宏基因组测序的方法，研究宫颈癌发生时宫颈微生物组的组成和功能变化。与对照组相比，宫颈癌患者宫颈微生物群以嗜碱菌属(Alkaliphilus)、假热菌属(Pseudothermotoga)和沃尔巴克氏菌属(Wolbachia)为主。宫颈上皮内瘤变 (cervical intraepithelial neoplasia，CIN) 患者的宫颈微生物中三分之二为乳杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和内膜念珠菌(Candidatus Endolissoclinum)。正常组宫颈微生物富含假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)和嗜冷菌属(Psychrobacter)。结果表明，宫颈病变患者和正常受试者的宫颈微生物群落组成及其宏基因组学特征存在差异。Yang等[35]的研究也同样证明了HPV16阳性女性阴道微生物组的组成发生了改变，例如乳酸杆菌减少和加德纳菌增加，包括其他机会性病原体，这表明伴随 HPV 感染的阴道微生物群失调很有可能导致HPV持续感染，甚至加速病变的进展。

3 结语

迄今为止，虽然对于宫颈癌的诊断和治疗已经取得了重大进展，如巴氏细胞学 (Pap)、阴道镜检查、醋酸肉眼检查 (visual inspection with acetic acid，VIA) 和组织病理学检查，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、测序以及放疗、化疗、手术、免疫治疗和靶向治疗等治疗方法，宫颈癌仍是影响全人类健康及生存的主要疾病之一，尤其是在发展中国家[36-38]。与此同时，蛋白质组学及其相关领域的研究取得了显著的进步，各种分析技术不断完善，高通量、高灵敏性、高稳定性的定量方法与定量策略也在不断更新，使我们对于蛋白质的组成、功能和表达有了更加深刻的认知。通过一系列的蛋白质组学技术，我们可以对宫颈癌相关蛋白进行详细地分析和鉴定。同时，宫颈癌生物标志物的发现，可以增加早期诊断和良好预后的机会，基于这些生物标志物，也可以开发新的有效疗法。 未来，随着蛋白质组学方法策略的不断改进和新技术的引入，蛋白质组学在宫颈癌的诊断和治疗中将会发挥越来越重要的作用。