卡楚拉，白伟琴，李 琦，乌仁达来，塔 娜，伊拉格其，格日勒图*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.锡林郭勒职业学院，内蒙古 锡林浩特 026000)

马腺疫(strangles)是一种马属动物感染马链球菌(Streptococcusequi，S.equi)而引起的急性、热性、高度接触性传染病。我国《一、二、三类动物疫病病种名录》(中华人民共和国农业部公告 第1125号)将该病确定为三类动物疫病[1]。S.equi主要感染幼驹，2月龄至4岁以下马匹易感。患病马发病后，由于下颌部淋巴结肿大而引起肿胀，随着脓肿的不断增大，脓汁会经鼻咽部，以黏脓性鼻液的形式排出体外，继发的炎症反应导致患畜体温升高。马腺疫发病率高，病死率低，传染性强，分布广泛，严重影响马产业的发展。国外研究统计，在2008年，英国出现近700例马腺疫疫情，最严重的一次引起了超过200匹马感染[2]。由于该病会引起下颌淋巴结肿胀而挤压器官，患病马会出现呼吸困难而尽力低头伸脖颈,出现机械性窒息，根据这一典型症状，才有了马腺疫这一名称[3]。

S.equi属于兰氏分群的C群β溶血链球菌，包括马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubspecies.Zooepdemicus,SEZ)、马链球菌马亚种(Streptococcusequisubspecies.Equi,SEE)、马链球菌类马亚种(Streptococcusequisubspecies.Ruminatorum,SER)等3个亚种，绝大多数马腺疫病例的分离菌均为SEE[4]。SEE在血平板上呈典型的β溶血生长，其形态与染色特征是由数十个细菌个体组成的菌链，细菌呈卵圆状，各菌大小不一，直径为0.7～1.5 μm，菌体着色不均，革兰阳性菌。研究报道称SEE来源于SEZ，两者DNA同源性很高，而区别两者的重要指标之一是SEE不发酵山梨醇，SEZ则发酵山梨醇和乳糖[5]。SEE可以在水中存活4～6周，但不能在粪便或土壤中存活。从患马的体内排出到栅栏和土壤上后，经过1～3 d后细菌会迅速死亡。SEE对来自外环境细菌的细菌素很敏感，在土壤中存在的菌群会抑制SEE的存活率[6]。

内蒙古自治区锡林郭勒盟一直是马腺疫常发地区，近来，锡林浩特市周边个别马场的部分马群中6～12月龄幼驹均出现以发热、上呼吸道及咽喉黏膜呈现卡他性炎症、下颌部淋巴结表现急性化脓性炎症为主要症状的病例。本试验在送检的18份临床样本中，均能分离出疑似菌，通过实验室常规诊断与分子生物学方法分离与鉴定分离菌的主要分类和遗传进化关系，成功分离出1株SEE，并分析与筛选出敏感性抗生素类药物，为当地马场及时诊断该疫病以及选择正确的抗生素类药物提供了依据。

1 材料与方法

1.1 病料及基本信息18份病料来自内蒙古锡林郭勒盟某马场。患病马出现精神萎靡、低头伸脖颈、单侧鼻孔流出黄绿色鼻涕、下颌部淋巴结肿胀等典型症状。对病马的下颌部淋巴结及周围进行消毒处理，使用无菌注射器抽取淋巴结内的脓汁，收集至无菌15 mL离心管后，送往实验室进行疑似菌的分离与鉴定。

1.2 主要试剂绵羊血琼脂平板购自广东环凯微生物科技有限公司；革兰染色液购自北京索莱宝科技有限公司；THB培养基购自青岛海博生物技术有限公司；核酸染料购自百泰克生物技术有限公司；Premix Taq酶、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；Steadypure 细菌基因组DNA提取试剂盒购自艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 疑似菌的形态特征观察使用铂金耳沾取微量脓汁均匀涂抹于无菌载玻片上，进行革兰染色并镜检观察疑似菌是否呈现出SEE的形态及染色特征。

1.4 疑似菌的分离与纯化使用铂金耳沾取脓汁，划线接种于绵羊血琼脂平板，37℃恒温培养箱中倒置过夜,观察菌落是否出现β溶血环及其他特征；挑取大小均一的单菌落进行革兰染色镜检。将疑似菌转接种至绵羊血平板进行纯培养，直至血平板上长出大小、形态均一致的露珠状菌落。挑取单个菌落，接种于THB培养基内，37℃、180 r/min振荡培养过夜，染色镜检，如显微镜下呈现形态特征相同的细菌，即获得纯化的菌悬液。

1.5 分离菌生长曲线的绘制取100 mL THB培养基至灭菌广口三角瓶，按照1∶100的体积分数接种菌悬液，37℃、180 r/min振荡培养，分别选取 0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32 h 时间点取样并测定培养液的D600 nm，以未接种的THB培养基作空白对照。以培养时间为横坐标，D600 nm为纵坐标绘制细菌生长曲线，共进行 3 次重复试验，并进行方差分析。

1.6 分离菌的生化鉴定参照马腺疫诊断技术(中华人民共和国农业行业标准NY/T571-2018)，对分离菌对数期菌悬液进行生化试验。依据《兽医微生物学实验教程》[7]中的常规方法，对分离菌进行蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、蕈糖、七叶苷、山梨醇、精氨酸脱羧酶分解试验、硝酸盐(还原)试验、胆汁溶菌试验、马尿酸盐分解试验、VP试验等进行鉴定。

1.7 分离菌16S rRNA测序鉴定取培养至对数期的菌悬液至1.5 mL 无菌离心管，参照Steadypure 细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取分离菌株基因组DNA，采用细菌通用引物27F/1492R用于分离菌的核酸鉴定(正向引物：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)。以分离菌基因组DNA为模板，PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸5 min，反应结束。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收约在1 500 bp处的PCR产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.8 分离菌遗传进化树的绘制测序结果经NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST系统进行检索，对分离菌的DNA 序列与同属的不同细菌在GenBank中录入的相关序列做比对，选取同源性高于99%的细菌为参考序列，应用MEGA 7.0生物软件绘制分离菌的遗传进化树，分析其遗传进化关系。

1.9 分离菌的药物敏感性试验依据NCCLS-药敏试验标准，采用K-B纸片琼脂扩散法，分析分离菌对阿莫西林、苯唑西林、头孢曲松、多西环素、红霉素、利福平、克林霉素、替考拉宁等药物的敏感性，测量抑菌圈，确定分离菌的药物敏感性情况。

2 结果

2.1 病原菌的形态特征将脓汁直接进行涂片并革兰染色后，在光学显微镜下清晰可见呈链状排列的革兰阳性菌和脓细胞，显示具有致病性链球菌的长链状排列特征(图1A)。

A.脓汁革兰染色镜检结果；B.革兰染色镜检结果；C.血琼脂溶血结果

2.2 疑似菌的分离与纯化在血平板上长出大小形态一致的露珠状小菌落，并出现了典型的β溶血环(图1 C)。挑取单菌落革兰染色后，镜检观察到由数十个细菌个体组成短的菌链，单个细菌呈卵圆状，呈阳性。与典型的SEE完全符合(图1B)。

2.3 分离菌生长曲线的绘制从绘制的生长曲线可知，分离菌在培养2～4 h后进入对数增长期，持续至16 h左右，16～20 h内进入平台期，而后进入衰亡期。经方差分析在3次重复试验的数据显示良好的重复性(图2)。

图2 分离菌生长曲线

2.4 分离菌的生化试验分离菌对蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖等糖发酵试验显示阳性，对乳糖、甘露醇、蕈糖、七叶苷、山梨醇等试验显示阴性(表1)；对精氨酸脱羧酶分解试验显示阳性，对硝酸盐(还原)试验、胆汁溶菌试验、马尿酸盐分解试验、VP试验显示阴性(表2)。

表1 糖发酵试验鉴定结果

表2 生化试验结果

2.5 分离菌16S rRNA测序结果将分离菌株在约1 500 bp处出现的特异性PCR产物经过测序后，所得到的16S rRNA基因序列与GenBank登录的序列进行BLAST比对分析发现，分离菌与已注册的马链球菌马亚种序列同源性为100%(图3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2.分离菌基因组DNA样品

2.6 分离菌遗传进化树的绘制应用MEGA 7.0软件绘制的遗传进化树上可以看出分离菌与新疆分离株XJALT-10-M2遗传距离最近，位于相同的分支(图4)。将该分离菌重新命名为马链球菌马亚种MDMC0316株，并成功注册于GenBank(登录号：OK254140.1)。

图4 基于16S rRNA基因序列的遗传进化树

2.7 分离菌的药物敏感性试验药敏试验结果显示，根据NCCLS-药敏试验标准，可以判定MDMC0316菌株对多西环素、红霉素敏感，对阿莫西林、苯唑西林、头孢曲松表示中介，对利福平、克林霉素、替考拉宁产生耐药性(表3)。

表3 药敏试验结果 mm

3 讨论

WALLER[2]研究认为，感染S.equi后处在潜伏期的马传播马腺疫的概率远远高于患病马通过化脓性分泌物传播的概率[8]。一些携带病原菌的马虽然常不表现任何马腺疫的典型症状，但是均处于潜伏期[9]。而此时，传统的马腺疫诊断方法无法及时做出正确的临床诊断，不能采取有效的预防措施，导致该疫病的暴发而造成马产业巨大的经济损失[10]。

本试验成功分离出1株SEE。通过观察MDMC0316株的染色及培养特性，在绵羊血琼脂平板上8 h内产生β溶血，并在脓汁里长链状排列，呈现出典型致病性链球菌的特性[11]。由于S.equi的3个亚种都有各自独特的酶系统，对底物的分解能力不同、产生的代谢产物也不同，所以在生化试验中绝大多数SEE不发酵山梨醇与乳糖，此特性正是区分S.equi的3个亚种的重要方法之一[12]。MDMC0316株对上述2种糖均表现为阴性，不利用该糖类。

根据16S rRNA测序结果绘制出的MDMC0316株遗传进化树，分析其遗传进化关系：分离菌与NCBI中已注册的马链球菌马亚种新疆分离株XJALT-10-M2遗传距离最近，表示该病原体具有极大概率来源于新疆维吾尔自治区。可能提示新疆与内蒙古马产业交易过程中，不严格检疫该类病原体，造成输入当地马群导致局部发病流行。

本次药物敏感试验只是作为紧急临床用药需求提供参考，在已备选的若干种抗生素当中，只有多西环素与红霉素2种抗生素类药物对MDMC0316株表现为最敏感。根据马场用药物敏感试验推荐药物治疗马腺疫的反馈情况看，上述2类参照抗生素治疗效果一般，患病马流脓症状改善不明显，但是大大缩短了康复期。试验本身也缺乏阳性和阴性标准对照，所得药物敏感性试验数据具有局限性。此外，临床实践结果表明，马腺疫混合感染情况也比较严重[13]，本试验分离细菌时也发现有些样品中伴有其他菌种的情况，是原发病混合感染还是采样时环境污染造成的问题需要进一步研究证实。

随着我国马产业的发展，马属动物的流通量逐年增加，因而马腺疫的传播率也在不断提高。在马腺疫的临床治疗中，广泛使用抗生素的疗效不佳，不仅仅是产生耐药性的问题，在恶性马腺疫病例用抗生素治疗后容易发生脓肿无法破溃而导致患病马匹体温长期呈稽留热状态，易发生其他并发症，甚至引起死亡[14]。美国和新西兰使用一种鼻腔黏膜免疫疫苗，但是该疫苗有极大的致病率，仍会造成受免疫马匹的感染，因而未得到广泛使用[15]。欧盟推出一款马腺疫的弱毒疫苗——Equilis StrepE(Intervet)[16]，虽然该疫苗在3个月内对受接种马匹能提供有效免疫保护，但个别马匹出现接种部位脓肿等不良反应。总之，在马腺疫疫苗防控中仍存在短期内无法克服的瓶颈问题。