马 力 马 静 张常喜

黑枸杞为茄科、枸杞属植物(Lycium Ruthenicum Murr)的干燥成熟果实。其味甘、性平，入肝、肾经，具有补肝强肾之功效，是一种常用的药食同源类中药。有研究表明，黑枸杞营养丰富，其多种营养成分皆为人体所需要，伍玉辉等[1]发现黑枸杞中含有大量氨基酸种类繁多，其中为人体所需的氨基酸有18种，还包括有机酸、脂肪、微量元素、蛋白质等,其次有研究发现黑枸杞中有超过blueberry的大量的黑果色素—天然原花青素(OPC)，是天然野生植物中发现的含量最高的野生植物。而且在实际应用中发现，黑枸杞在临床上治疗肝病具有很好的疗效，其对肝纤维化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等多种肝脏疾病具有很好的预防和治疗效果，证明了黑枸杞的补肝功效，但目前黑枸杞补肝的作用机制尚未阐明。除此之外它还具有抗疲劳、抗肿瘤、增强免疫功能、保护血管内皮细胞、调节血脂、延缓衰老等作用。而在中医相关黑枸杞的研究中显示黑枸杞具有补肝肾、明目、健脾益胃、补脑以及抗衰老等作用。本研究拟以中医理论为指导，运用现代科学技术和手段，研究黑枸杞补肝作用机制，为更好地开发应用黑枸杞提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验肝干细胞SD大鼠肝干细胞系WB-F344[许可证号：SCXK(湘)2016-0002，湖南斯莱克景达实验动物有限公司]。

1.1.2 实验黑枸杞黑枸杞(宁夏杞爱原生黑果枸杞股份有限公司)

1.1.3 实验试剂Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒(CW0581M，CWBIO 康为世纪)，UltraSYBR Mixtur(CW0957M，CWBIO 康为世纪)，Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO 康为世纪)，HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒(CW2569M，CWBIO 康为世纪)。

1.1.4 实验仪器-80 ℃冰箱(BDF-86V348，BIOBASE)，移液枪(20～200 μl，0.1～2.5 μl，0.5～10 μl，eppendorf)，单道可调移液器(0.5～10 μl，20～200 μl，100～1000 μl，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，干式电加热器(GL-150，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，微型离心机(D1008E，SCJLOGEX)，旋涡混合器(XH-C，常州越新仪器制造有限公司)，低温高速离心机(TGL-16G，常州中捷实验仪器制造有限公司)，紫外可见分光光度计(UV-1600PC，上海美谱达仪器有限公司)，荧光PCR仪(CFX ConnectTM实时，伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠药物血清制备药物血清制备：SD大鼠2只，雄性，连续药物(0.15 g/ml的黑枸杞溶液)灌胃7 d(每天1次)，末次给药后2 h，麻醉心脏取血，后静置离心分析血清，于-80 ℃保存备用。

1.2.2 肝干细胞培养实验药物血清处理组加入SD大鼠含药血清处理(含药血清量10%)，空白组加10%磷酸盐缓冲液(PBS),空白血清处理组加不含药胎牛血清(FBS)10%。WB-F-344细胞的传代：弃去培养上清，1×PBS洗两遍，0.25%胰酶消化3 min，加入培养基终止消化并悬起细胞；收集细胞至10 ml离心管中，1000 r/min离心 3 min，弃尽上清，加入DMEM完全培养基吸管吹匀；将上述细胞悬液稀释至适宜细胞密度后加入准备好的培养瓶中，于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。取血后加抗凝剂,静置1～2 min,置入离心机内以3000 r/min离心15 min,用移吸管吸出分散的血清(上层乳黄色的上清液),反复2次得较纯血清,放置-20 ℃冰箱储存。

1.2.3 糖原染色(PAS)实验培养状态良好的细胞，去除培养基，加4%组织细胞固定液固定15 min，然后用自来水冲洗3 min，再用蒸馏水浸洗2次，1 min/次，然后再滴加过碘酸溶液，室温静置7 min，再用自来水冲洗1 min,蒸馏水浸洗2次，1 min/次，然后再滴加Schiff Reagent，置于室温阴暗处，浸染15 min，自来水冲洗10 min，最后再滴加苏木素染色液，染 2 min，酸性分化液分化2～5 s，自来水冲洗10 min，再用蒸馏水冲洗，镜检。

1.2.4 肝干细胞激光共聚焦实验激光共聚焦实验铺板：弃去培养上清，1×PBS洗两遍，0.25%胰酶消化3 min，加入培养基终止消化并悬起细胞；收集细胞至10 ml离心管中，1000 r/min离心3 min，弃尽上清，加入DMEM完全培养基吸管吹匀后将细胞培养液铺于6孔板中，24 h后细胞贴壁后按实验方案处理细胞。(1)细胞的固定 在培养板中将已爬好细胞的培养皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定 15 min，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min；(2)细胞的通透 0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min。(3)封闭 PBS浸洗培养皿3次，每次5 min，移液枪吸干PBS，在培养皿内滴加5% BSA，37 ℃封闭30 min。(4)免疫反应 一抗 移液枪吸掉封闭液，不洗，培养皿内滴加足够量的稀释好的一抗CK19(1∶200)，AFP(1∶50)，37 ℃孵育3 h。(5)加荧光二抗PBS浸洗培养皿3次，每次3 min，移液枪吸干培养皿内多余液体后滴加稀释好的荧光二抗Cy3(1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培养皿3次，每次3 min。(6)核染定位 复染核:滴加DAPI避光孵育5 min,对标本开始染核,用PBS清洗剩余的DAPI;封片:用50%甘油密封培养皿,并且在荧光显微镜下观察收集图片。

1.2.5 肝干细胞PCR实验(1)细胞收集：①用移液枪吸掉培养皿中的细胞培养液。②在培养皿中加入Trizon 裂解液，根据细胞量每皿加入1 ml Trizon。③用移液枪吹打，使贴壁细胞悬浮与裂解液充分接触，将全部细胞悬液转移到1.5 ml 离心管中，保存在-80 ℃，防止降解。(2)RNA提取：①向以上溶液中加入氯仿，每使用1 ml Trizon后加入0.2 ml 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15 s，冰盒上放置5 min。②4 ℃，12 000 r/min离心15 min，此时样品分成3层：红色有机相层、中间层、无色水相层，RNA主要在水相层中，把水相层(约500 μl)转移到一个新的预冷1.5 ml RNase-Free 离心管中。③在得到的水相溶液中加入等体积预冷的70%乙醇，颠倒混匀。④将上述溶液加入到已装入收集管的吸附柱RM中，在 4 ℃，12 000 r/min 离心30 s，弃流出液。⑤加入700 μl RW1洗涤沉淀。4 ℃，12 000 r/min 离心30 s，弃流出液。⑥加入500 μl RW2洗涤沉淀。4 ℃，12 000 r/min 离心30 s，弃流出液。⑦重复步骤⑥。⑧弃流出液后，空转离心2 min，弃流出液。⑨冰盒上存放5 min,晾干。将吸附柱装入到一条新的预冷1.5 ml RNase-Free离心管中,加入 30 μl 无RNase的水,完全水解RNA,静置3 min,4 ℃,12 000 r/min离心1 min。把回流液再加入到吸附柱当中,静置3 min,4 ℃,12 000 r/min离心1 min。所得的RNA保持在-80 ℃,避免分解。(3)RNA浓度、纯度测定：①打开紫外可见分光光度计预热20 min，从30 μl体系的RNA溶液中吸取5 μl，与45 μl的RNase free water混合均匀(即将RNA溶液稀释10倍)。②在260 OD下测定其数据并记录，再在280 OD下测定数据并记录。③根据公式计算：A260 ×稀释倍数×40=RNA ng/μl(浓度);1.8≤A260/280≤2.0(纯度)。见表1。(4)逆转录将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒合成CDNA：①逆转录体系 参照试剂盒说明书以4.9 μg总RNA为模板进行逆转录，按下表配制反应体系混合液。见表2。②涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。③加入①②③后70 ℃孵育10 min，再迅速冰浴 2 min。④再加入④⑤⑥50 ℃孵育15 min，85 ℃孵育 5 min。反应结束后，短暂离心，置于-80 ℃冰箱，以防降解。(5)荧光定量PCR 根据各指标基因序列，设计其特异检测引物，以细胞的总RNA为模板，q-PCR检测各基因的表达情况。见表3。

表1 RNA浓度及纯度表

表2 逆转录反应体系表

表3 引物信息表

1.2.5 统计学方法实验所用数据皆运用GraphPad Prism 5来统计分析，经t检验显著性差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 (PAS)实验肝干细胞(Liver stem cell)与肝细胞的生长、发育、增殖甚至纤维化程度等有着密切的关系，为了研究黑枸杞的补肝机制，本研究中选用肝干细胞系WB-F344细胞进行实验。阳性物质呈红色或紫红色，细胞核呈蓝色，细胞质呈深浅不一的红色。此结果提示黑枸杞能够促进肝干细胞诱导分化成肝细胞。实验结果与前期研究所发现的黑枸杞具有促进肝干细胞增殖，抑制其凋亡的结论相符合。见图1。

图1 肝干细胞(PAS)实验结果

2.2 肝干细胞激光共聚焦结果采用免疫荧光检测技术研究黑枸杞溶液对肝干细胞分化的影响。实验时，将细胞固定、打孔、封闭后进行免疫反应，通过加入甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK-19)或白蛋白(Albumin,ALB)孵育一定时间，再加入荧光二抗Cy3，染细胞核，再通过共聚焦显微镜观察细胞染色情况。其中红色荧光为检测的目的蛋白，蓝色荧光为细胞核。与空白组和不含药组相比，含药组的红色荧光很明显。此结果表明黑枸杞应该能够诱导肝干细胞向肝细胞、胆管上皮细胞分化的作用。见图2。

图2 肝干细胞激光共聚焦实验结果

科学研究表明肝干细胞的生长、增殖和分化受各种细胞因子控制，如肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)[2]等能促使肝干细胞的增殖，转化生长因子β(TGF-β)[3]等能诱发其凋亡,并抑制生长,表明细胞生长因素可以在重度肝损害后肝干细胞的启动、生长和分化过程调节中起作用。此外,调控肝干细胞增生与分离涉及细胞外基质、细胞内转录因子、信号通道Wnt、Notch、Hedgehog、BMP/TGFβ、PI3K、AKT等[4]，Wnt-βcatenin信号通道与肝细胞的形成相关，Wnt1量的变化决定着卵圆细胞向肝细胞的分化，Notch信号通道与肝细胞增殖、胆管及新生血管形成相关，对肝脏损伤后重塑起重要作用[5]。肝干细胞诱导分化决定着肝细胞再生和肝损伤修复，直接影响肝病的治疗和预后。通过提取大鼠肝干细胞中的RNA，并将RNA逆转录为cDNA，再进行荧光定量PCR实验。PCR结果显示，CYP1A1、wnt-1和notch2的mRNA的表达均降低，该结果提示黑枸杞可能通过下调wnt-1和notch2通路，诱导肝干细胞分化。见表4、表5。

注：与空白对照组比较，*P<0.05。图3 肝干细胞PCR实验结果条形图

表4 黑枸杞对CYP1A1 Notch2 Wnt-1表达的影响

表5 黑枸杞对CYP1A1 Notch2 Wnt-1影响的显著性差异分析表

总之，研究结果表明，黑枸杞可通过下调wnt-1和notch2通路(PCR实验)，促进肝干细胞向肝细胞、胆管上皮细胞分化，调节肝细胞再生和修复(PAS和PCR对CYP1A的检测)。

3 讨论

有多种研究表明Wnt1信号能够调控机体的发育、生长、衰老和死亡, 成体组织细胞的分化、增殖及凋亡都和它有着密不可分的关系[6,7]。当肝脏受损时，残存的肝组织就会再生，而肝脏的再造功能与肝干细胞也是离不开的[8]。肝干细胞是指产生在成熟肝的Herring狭隙中的一类有双向分化潜能的细胞,在肝细胞遭受破坏时或肝细胞的再生遭到抑制时,它们能够生长、分化形成不同的肝细胞与胆管细胞,从而参加肝构造与功能的重组，具有干细胞特点的一类细胞[9,10]。而且肝干细胞来源也有不同，由此可以将肝干细胞分为2类，即：肝源性肝干细胞、非肝源性肝干细胞[11]。肝源性肝干细胞又可以分化为肝卵圆细胞等多种细胞形态，而当肝脏受到损伤时，肝卵圆细胞就会分化为肝细胞，帮助肝脏再生[12-14]。有实验发现Wnt-βcatenin信号通路与肝脏细胞的形成相关，其中Wnt1量的变化决定着卵圆细胞向肝细胞的分化[15，16]。相关研究表明卵圆细胞有导致胆管癌或肝细胞癌的倾向，而阻断Wnt1信号通道可阻碍卵圆细胞分化为肝细胞[17]。细胞色素P450(Cytochrome P450)是一组含亚铁血红素的同工酶，是至关重要的一类酶，它在人体中有许多作用，例如：可以帮助一些药物进行生物转化(即药物代谢)；它具有催化功能，可以对一些物质进行催化作用，例如许多前致癌物和前毒物的活化过程就离不开其的催化作用。有研究表明，当细胞色素CYP1A1被激活后，能引起细胞内钙释放、活性氧增多进而产生细胞内的氧化应激和内质网应激，激发Caspase通路诱导细胞凋亡，产生肝毒性作用[18]，当阻断CYP1A1的表达，可以有效减少肝脏的损伤。Notch信息通道由Notch受体、Notch配体、CSLDNA融合蛋白质、其他的效应物和Notch的调控分子等构成。Notch信号通路与肝纤维化相关,研究发现Notch能与生长转化因子相互作用增强或减少EMC,选择性的介导纤维化产生[19,20]。本研究采用pcr技术检测黑枸杞作用于肝干细胞系WB-F344后，通过抑制Wnt1等相关信号分子的表达，从而对肝脏起到保护作用。因此得出结论加药血清对肝干细胞系WB-F344能产生影响。