沈燕如，泥永淘，胡伟，李磊，欧珠罗布

1.西藏大学附属阜康医院消化内科，西藏拉萨 850000；2.西藏大学附属阜康医院实验室，西藏拉萨 850000；3.西藏大学医学院，西藏拉萨 850000

《2020全球癌症报告》显示，2018年全球结直肠癌新发193万例，死亡93万例，居第3位常见癌症和第2位常见癌症死亡原因[1]。纵观国内，结直肠癌位居第3位常见癌症和第5位常见癌症死亡原因[2]。与结直肠癌发病相关的主要基因突变靶点和信号调控通路中，研究最多且最典型的是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）所介导的信号传导通路，而K-ras、PIK3CA基因是导致EGFR下游信号通路持续激活的主要原因之一。西藏海拔高，特殊环境及饮食背景下，藏族结直肠癌患者K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达情况及其相关性值得探究，但目前鲜有相关研究报道。基于 此，本研究选取2020年9月—2021年9月于西藏大学附属阜康医院就诊的70例藏族结直肠癌患者为研究对象，分析藏族结直肠癌患者K-ras、PIK3CA基因突变与EGFR基因表达情况及三者之间的相关性，旨在为藏族结直肠癌患者分子靶向治疗提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取于本院诊治的藏族结直肠癌患者70例为研究对象。本研究通过西藏大学附属阜康医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。70例患者中男43例，女27例；年龄34～75岁，平均（53±11.8）岁。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①手术切除肿瘤组织/内镜活检组织病理确诊结直肠癌；②临床资料完整；③世居西藏。排除标准：①有放疗或化疗史者；②合并其他恶性肿瘤者。

1.3 方法

1.3.1荧光定量PCR法检测K-ras、PIK3CA基因突变将石蜡包埋的结直肠癌组织5 μm厚切片，连续切10张。DNA提取试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）提取切片中的结直肠癌组织DNA，K-ras基因突变检测试剂盒和PIK3CA基因突变检测试剂盒检测K-ras基因第2、3、4外显子和PIK3CA基因第20外显子突变情况。

1.3.2免疫组化SP法检测EGFR基因表达EGFR单克隆抗体（鼠抗人）、pv-6000试剂盒、DAB染色液、PBS缓冲液（粉末）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按照试剂盒说明进行实验操作，采用PBS代替一抗作阴性对照，已知的阳性切片作阳性对照。以细胞质或细胞膜出现清晰棕黄色颗粒为阳性。

1.4 观察指标

分析藏族结直肠癌患者K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达情况，三者与临床病理特征的关系及三者之间的相关性。

1.5 统计方法

采用SPSS 25.0统计学软件处理数据，计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达情况分析

70例藏族结直肠癌患者中有28例存在K-ras基因突变，突变率为40.0%；6例存在PIK3CA基因突变，突变率为8.6%；43例EGFR基因呈阳性表达，阳性率为61.4%。

2.2 K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达与临床病理特征关系

K-ras基因突变率，右半结肠癌患者高于左半结肠癌患者、TNMⅢ～Ⅳ期结直肠癌患者高于TNMⅠ～Ⅱ期结直肠癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄分层（分为≥60岁和＜60岁）、性别、肿瘤直径（分为≥5 cm和＜5 cm）和分化程度的结直肠癌患者之间K-ras基因突变率差异无统计学意义（P＞0.05）。PIK3CA基因突变率，低分化结直肠癌患者高于中高分化结直肠癌患者，TNMⅢ～Ⅳ期结直肠癌患者高于TNMⅠ～Ⅱ期结直肠癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄分层、性别、原发部位和肿瘤直径的结直肠癌患者之间PIK3CA基因突变率差异无统计学意义（P＞0.05）。EGFR基因阳性表达，TNMⅢ～Ⅳ期结直肠癌患者高于TNMⅠ～Ⅱ期结直肠癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄分层、性别、原发部位、肿瘤直径和分化程度的结直肠癌患者之间EGFR基因表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 藏族结直肠癌患者K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达的相关性

5例患者存在K-ras基因和PIK3CA基因共同突变。K-ras基因突变和PIK3CA基因突变之间存在正相关（r=0.271，P=0.023）。19例患者存在K-ras基因突变且EGFR基因阳性表达，但K-ras基因突变和EGFR基因阳性表达之间无相关性（r=0.108，P=0.374）。4例患者存在PIK3CA基因突变且EGFR基因阳性表达，但PIK3CA基因突变和EGFR基因阳性表达之间无相关性（r=0.033，P=0.787）。

3 讨论

EGFR又称HER-1，为HER/erbB家族成员，在缺乏特异性配体时，其处于抑制状态，当EGFR配体与EGFR胞外结合域结合后可致EGFR二聚化和激活。一些恶性肿瘤细胞异常产生EGFR配体，以自分泌方式激活EGFR，另外EGFR亦可以被自身的突变激活。EGFR的激活刺激下游通路（RAS/MAPK和PI3K/AKT信号通路等）的激活，导致癌细胞增殖。EGFR存在于细胞质及细胞膜表面，在癌组织中表达最高，在腺瘤中表达中等，在正常上皮中表达极低。本研究结果显示，EGFR基因阳性表达率较高，为61.4%，与文献报道基本一致[3]。

K-ras属RAS基因家族，是癌症中最常突变的癌基因。K-ras基因编码的K-ras蛋白有GTP酶活性，其如同一个分子开关，在活化和非活化的信号传导结构之间循环。K-ras蛋白结合GTP时为活化态，K-ras蛋白与下游信号分子结合并激活相应效应分子，信号实现传递；当GTP水解且K-ras蛋白结合GDP时为失活态，信号被阻止。当K-ras基因突变后，K-ras蛋白的GTP酶活性降低，其水解GTP能力下降，与GTP牢固结合，持续处于活化态，从而放大下游信号通路。这导致细胞内信号转导紊乱，细胞不依赖EGFR地激活信号，持续增殖甚至癌变[4]。本研究结果显示，K-ras基因突变率为40.0%，与文献报道基本一致[5-6]。

PI3K/AKT是EGFR激活的第2个主要信号通路。EGFR与配体结合激活PI3K。PI3K由催化亚基p110和调节亚基p85组成。p110可使PIP2磷酸化生成PIP3，PIP3随后激活AKT，而AKT可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。PIK3CA是编码p110的基因，正常细胞中p110为低活性，当PIK3CA突变后可通过激活p110，刺激AKT信号而致细胞增殖和侵袭。本研究中PIK3CA基因突变率为8.6%，朱凤伟等[6]研究结果显示结直肠癌患者中PIK3CA突变率为5.67%，而Poulsen TS等[7]研究得出PIK3CA在结直肠癌患者中突变率为18.8%，该差异可能与民族及环境有关。

进一步分析K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因阳性表达与临床病理特征的关系，本研究显示右半结肠癌患者及TNMⅢ～Ⅳ期结直肠癌患者Kras基因突变率更高。本结果与美国癌症数据库分析的19877例无转移结直肠癌患者的相关研究结论相一致[8]。有研究表明K-ras基因突变同结直肠癌的转移密切相关[9]。本研究显示K-ras基因突变与年龄、性别、肿瘤直径和分化程度无关。朱凤伟等[6]研究发现K-ras基因突变与患者年龄、性别、肿瘤大小无关，此与本研究结果一致。但不同的是其研究显示K-ras基因突变与肝转移和临床分期亦无关。另也有研究指出K-ras基因突变率随年龄增加而升高[10]。分析上述不同可能与样本量及民族地域差异有关。本研究显示，低分化结直肠癌患者及TNMⅢ～Ⅳ期结直肠癌患者PIK3CA基因突变率更高。刘鑫等[5]研究亦发现Ⅲ～Ⅳ期结直肠癌患者其PIK3CA基因突变率更高。但另有研究显示，PIK3CA基因突变与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及临床分期均无关[6]，该差异可能与肿瘤异质性有关，还需进一步研究验证。本研究中TNMⅢ～Ⅳ期结直肠癌患者EGFR基因阳性表达率更高。Nemanqani DM等[3]研究亦发现EGFR在晚期结直肠癌中有较高的表达。本研究显示不同年龄分层、性别、原发部位、肿瘤直径和分化程度患者之间EGFR基因表达差异无统计学意义（P＞0.05）。而Lawan AI等[11]研究显示肿瘤大小与EGFR阳性表达之间存在关联，与本文不一致，可能与本研究样本量较少有关。

本研究中，有5例患者存在K-ras基因和PIK3CA基因共同突变（突变率为7.1%），两者之间存在正相关，与报道一致[12]。但K-ras、PIK3CA基因突变与EGFR基因阳性表达之间无相关性。有研究指出K-ras基因突变与EGFR基因突变几乎不会同时出现，考虑两者的基因突变在肿瘤的发生中是独立存在的[13]。抗EGFR单抗是结直肠癌最常用的靶向药物，抗EGFR单抗能结合EGFR的胞外区域阻止配体与EGFR结合，抑制EGFR及其下游信号通路的激活。K-ras基因突变后可抵抗EGFR单抗，导致EGFR单抗治疗无效[14]。在EGFR单抗治疗无效的患者中，K-ras基因突变占30%～40%，有研究提出PIK3CA基因突变可能是导致K-ras野生型患者EGFR单抗治疗无效的原因[15]。目前，多数学者认为K-ras和PIK3CA基因突变状态与化疗疗效相关。美国综合癌症网络NCCN指南[16]建议所有转移性结直肠癌患者进行K-ras基因突变检测，K-ras基因突变患者不建议应用西妥昔单抗和帕尼单抗。西藏藏族群居于高原环境，饮食习惯与低海拔区人群有明显不同，藏族人群结直肠癌疾病特征及K-ras、PIK3CA基因突变及EGFR基因表达情况自有特点。本研究中，存在样本量小、，缺乏生存随访等缺陷，需进一步探究。

综上所述，70例藏族结直肠癌患者中K-ras基因突变率为40.0%，PIK3CA基因突变率为8.6%，EGFR基因阳性表达率为61.4%。K-ras基因突变和PIK3CA基因突变存在正相关，但K-ras、PIK3CA基因突变与EGFR基因阳性表达之间无相关性。所以，在结直肠癌进展过程中，K-ras基因和PIK3CA基因可能是协同作用，而K-ras、PIK3CA基因与EGFR基因可能是相关独立作用，对此还需进一步研究。有必要对藏族结直肠癌患者进行K-ras、PIK3CA基因突变和EGFR基因表达检测，不但有利于精准治疗，改善预后，同时也可为完善藏族结直肠癌基因突变情况提供研究参考。