赵 芳，李红侠，刘 宇,鲍道源

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

染料木素(Genistein,Gen),属于大豆异黄酮苷元[1]，广泛存在槐、葛根和大豆等中，有抗肿瘤活性[2]、抗氧化[3]和神经保护作用等[4-5]，大量的研究及相关实验证明，染料木素对癌症、炎症、绝经后症状、骨质疏松和心血管疾病等多种病症都具有较好的治疗效果[6-8]。前列腺癌和乳腺癌在亚洲人中发病概率较低，就被归因于亚洲人大量摄入的大豆产品中含有高水平植物雌激素——染料木素；与其他异黄酮类化合物相比，结构类似于17β-雌二醇(E2)，与其竞争雌激素受体(ER)，对ER-α的亲和力为E2的4%，对ER-β的结合力为E2的87%[9]，从而在激素相关癌症的治疗中发挥良好的作用。EGFR-TKI 的出现使过去许多不能治疗的恶性肿瘤得到有效控制，然而由于当前的药物具有毒副作用和耐药性的缺点，因而研发高效、低毒的药物迫在眉睫[10-11]。目前，国内外研究表明，染料木素衍生物具有比母体更高的生物活性[12-13]，尤其在抗癌方面[14-16]。

肺癌属于最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症的相关死亡中，占比较高[17]。近几十年来在肺癌的诊断及治疗方面取得非常显著的进展，但5年生存率不高于百分之二十，肺癌属于一种发病率和死亡率都高的恶性肿瘤，目前最有效的治疗手段包括手术切除辅以放疗和化疗[18]。

哌嗪是药物化学中经常使用的一类含氮杂环的碱性基团，易与蛋白形成多个氢键或者离子键，能有效调节药物的酸碱平衡常数和脂水分配系数。将哌嗪引入分子中，能有效增加分子的水溶性和碱性，通过调节药物的理化性质，改善药物的药代动力学性质，从而提高分子的生物活性效增强，抗癌活性好[19-20]。本实验以染料木素为原料，引入哌嗪，合成一种新型染料木素衍生物(GeD)，通过对人非小细胞肺癌细胞的抗增殖活性影响,以期为今后的新药物研发提供思路和依据。

1 实验部分

1.1 实验材料、仪器、药品

实验材料:人非小细胞肺癌细胞株(A549),人肾上腺上皮细胞株(293T),均由生物与食品工程学院生物实验室提供。

主要实验仪器:三用紫外分析仪,上海青浦泸西仪器厂;XT4型熔点仪,北京泰克仪器有限公司的XT4型熔点仪;水平式细胞离心机,北京雷勃尔离心机有限公司;Thermo 371 CO2培养箱,上海道尚生物科技有限公司;倒置显微镜,美国 Thermo公司;酶标仪,美国Thermo公司;红外线光谱仪(AVATAR370),日本日立公司;Accuri C6流式细胞仪,美国BD公司。

主要药品：染料木素、2-氟苯基哌嗪(阿拉丁)、胎牛血清、胰蛋白酶和Annexin V-FITC/PI试剂盒(Beijing Solarbio Sicence Technogy Co.Ltd)；DMEM培养基(南京化学试剂有限公司)；MTT(国药集团化学试剂有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 药物的合成

依次准确称取染料木素1 mmol,1-2F苯基哌嗪1 mmol于50 mL的反应瓶中，加无水乙醇30 mL，甲醛80 μL，置于油浴锅加热，温度80 ℃，时间48 h,TLC跟踪，反应停止后，柱层层析，得染料木素的衍生物即药物8 -((4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)-5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)-2H-色烯-4-酮(文中以GeD代替)。

1.2.2 药物的抗癌活性

(1)细胞培养。细胞培养液为DMEM高糖培养基，10%的胎牛血清，1%的双抗。细胞培养条件5% CO2，温度37 ℃培养箱中培养。待细胞瓶中的细胞长至90%时，终止培养，进行细胞活性实验。

(2)缓冲液配制。PBS的配制:准确称取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.63 g、KH2PO40.24 g分别用超纯水溶解调节pH至7.4，定容至1 L灭菌121 ℃，20 min， 4 ℃冰箱保存。

(3)药液的配制。准确称取药物GeD0.002 g，DMSO溶解，配成20 mg每升的母液，于-20 ℃冰箱保存，用时稀释。

(4)肿瘤细胞的增殖活性。

①铺板：取96孔板，外围一圈加100 μL PBS。其余各孔加细胞液，将对数期的A549细胞，稀释至预计浓度(用培养液调整细胞密度至1×105个/ mL)后，分别加100 μL细胞液,置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

②加药：12 h后，吸走原培液，第2列加100 μL培养液，第3列加细胞悬浮液100 μL，作为阴性对照。其余各列分别加药，设4个浓度梯度(10、25、50、100 μmol/L)，3个重复,放入37 ℃，5%CO2培养箱继续培养24 h和48 h。

③加MTT：24 h后，于避光环境下，每孔各加15 μL 5%的MTT,继续避光培养4 h。

④加DMSO：4 h后吸去培养液，加150 μL的DMSO，水平摇床振荡8～10 min。用酶标仪，在490 nm波长下测OD值。

⑥细胞毒性实验。取对数生长期293T细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×105个/mL，每孔100 μL，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养12 h。设置对照组和药物组，每组设3个平行；药物组加入不同浓度梯度的GeD溶液共孵育24 h。各孔加入15 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。弃去孔内液体，然后加入150 μL DMSO，震荡8～10 min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光值(OD)，重复三次。

(5)凋亡检测

①选取对数期的A549细胞铺六孔板。

②待细胞完全贴壁，细胞数量达到1×106后，吸去培养液。分别加入0 μmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L浓度的GeD，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。

③24 h和48 h后，每孔各加500 μL胰酶，大约1～2 min后，终止消化，吹打均匀后吸入2 mL的EP管中，3 400 r/min离心，时间5 min。

④轻轻吸去上层溶液，每管各加冷的PBS 1 mL，吹打均匀后，3 400 r/min，离心4 min。

⑤重复上一步骤后，用冷的PBS洗2次，吸去上层溶液，每管加入500 μL结合液，混匀后各加5 μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Iodide染色，25 ℃避光反应10～15 min。

⑥在1 h内进行流式细胞仪检测。

2 结果分析

2.1 药物的性质和表征

目标化合物名称：8-((4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基)甲基)-5,7-二羟基-3-(4-羟基苯基)-4H-色烯-4-酮，颜色为黄色，产率为66.5%，熔点为166-169 ℃1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ: 12.82(S,1H),8.16(S,1H),7.15-7.14(d,J=8.46 Hz,3H),6.83-6.80(m,3H),6.73-6.70(m,2H),6.60-6.58(d,J=8.46Hz,2H),6.03(S,1H),2.87(S,4H),2.45(S,4H),2.27(m,4H)。IR(KBr):3 313.14，2 968.19，2 826.67，1 652.20，1 586.54，1 509.68，1 475.14，1 440.97，1 371.43，1 353.82，1 322.80，1 258.37，1 192.19，1 175.09，1 150.63，1 116.01，1 060.51，1 027.90，1 007.19，938.73，920.11，902.04，889.26，878.10，837.81，794.23，758.84，720.54，707.25，673.58，617.85，559.67，537.03。分子式为：C26H23FN2O5，分子量：462.48。

图1和图2分别是C26H23FN2O5的1H NMR谱图和IR谱图。

图1 C26H23FN2O5 的1H NMR谱图

图2 C26H23FN2O5的IR谱图

由以上1H NMR、IR谱图可确认，合成结果的为目标产物，以GeD来代替。

2.2 药物的抗癌活性

2.2.1 药物对293T的毒性影响

GeD对人肾上腺上皮细胞株(293T)的半数细胞毒性浓度(CC50值)为123.83 μM,可知GeD对正常人体细胞毒副作用很小。

2.2.2 药物抗癌活性的检测结果

由表1可知，GeD对A549,24 h的IC50值为31.67 μM，48 h的IC50值为20.32 μM，说明药物的抗增殖活性存在时间上的依赖性。

表1 药物对A549的抗增殖活性IC50值( μM)

2.2.3 流式细胞仪的检测结果

图3是药物处理24 h细胞凋亡散点图。0 μM即对照组，未用GeD处理，早期细胞凋亡2.76%，晚期细胞凋亡2.48%，正常的细胞占有率为94.4%，机械原因造成死亡的细胞的占有率0.4%，生长的很好；在浓度为2 μM时，早期凋亡率为5.21%，晚期凋亡率为9.18%，对A549有轻微抑制作用；在浓度为6 μM时，早期凋亡率为10.6%，晚期凋亡率为6.34%，对A549仍为轻微抑制作用，相较2 μM时抑制效果有所上升；在浓度为8 μM时，早期凋亡率为14.6%，晚期凋亡率为10.6%，对A549抑制作用较好，相较2 μM、6 μM时抑制效果提升明显。根据浓度从低到高各浓度GeD处理的细胞凋亡率与对照组对比可得，GeD对A549有明显的抗增殖作用，且抑制效果随GeD浓度的增加而增强。

图3 目标化合物对A549培养24 h后的细胞凋亡

图4是药物处理48 h细胞凋亡散点图，在浓度为2 μM时，凋亡细胞为20.65%，较24 h的用药增加了6.26%，在浓度为6 μM时，凋亡细胞为28.06%，较24 h的用药增加了11.12%，在浓度为8 μM时，凋亡细胞为43.3%，较24 h的用药增加了18.1%，由此可见，当药物浓度不变时，随着时间的延长，凋亡率逐渐增加，且浓度越大，影响也越大。

图4 目标化合物对A549培养48 h后的细胞凋亡

3 结 语

经氢谱、红外光谱等测定手段，确定合成的目标化合物(GeD)的结构。293T的细胞毒性实验表明，其CC50值为147.15 μM，说明新型染料木素衍生物的毒副作用很小。体外抗癌活性实验表明，合成药对A549的IC50值在24 h、48 h时分别是31.67 μM和20.32 μM，药物具有较好的抗增殖活性，流式细胞术的检测结果，表明细胞的凋亡率随药物的浓度、时间的增加而成依赖性增加。