向丽萍，吴金春，覃宇，张祖文，李霞，王兰兰

遵义市产品质量检验检测院，贵州 遵义 563000

边销茶作为销往边疆少数民族地区的紧压茶,其生产成品主要为茯砖、康砖、青砖、金尖、花砖、黑砖等。黑砖、茯砖、花砖作为边销茶中的主要几种茶叶类别，在加工过程中会进行“人工发花”，其原理是让微生物在湿热等条件下大量繁殖发生特殊的反应形成“金花”，俗称金花菌[1-2]。金花菌能使茶叶转化多酚类物质，改善茶叶的品质，有清除自由基、降脂、降压以及调节糖类代谢的功效[3]。“金花菌”的数量和质量对于判定茯砖茶品质好坏起重要作用[4]。

现阶段针对“金花菌”开展的研究有感官质量评价、ITS通用引物测序分析、微生物菌落形态特征等方面。“金花菌”通常意义上主要是指冠突散囊菌，但边销茶中散囊菌属有很多类，包含冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、匍匐散菌（Eurotium repens）、间型散囊菌（Eurotium intermedius）、谢百散囊菌（Eurotium chevalieri）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）、赤散囊菌（Eurotium rubrum）和一种未定名的散囊菌（Eurotiumsp），其中前5 个菌是优势种类[5]。许多文献表明，ITS 通用引物分析鉴定“金花菌”只能鉴别到真菌门类曲霉属子囊菌纲，到具体哪一种真菌存在一定不确定性，通过NCBI网站Blastn比对分析，同源性高达99%以上的真菌种类有多种[6]。筛选Score得分最高的和相似性最强的前十几条目录，可以知道“金花菌”中散囊菌的范围，优势真菌群为哪几类。本研究从收集的15组边销茶茶样中检测其“金花菌”菌落数量，ITS 通用引物测序分析测出各茶样之间亲缘性强弱，筛选优化出一种快速提取其“金花菌”DNA的方法，为后续开展“金花菌”的研究，提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶样来自10 家边销茶生产企业（贵州省9家、湖南省1家），生产于2012—2021年间。

供试药品：氯化钠（分析纯），天津科密欧生化试剂有限公司生产；孟加拉红琼脂，广州陆桥检测技术有限公司生产；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（细菌真菌直接裂解液）、Premix TaqTM、琼脂糖（Agarose）、DL1000 DNA Maker、6*Loading Buffer 均由宝日医生物技术（北京）有限公司生产；GeneGreen 核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司生产。

主要仪器设备：生物安全柜，苏净安泰空气技术有限公司生产；隔水式霉菌培养箱、全自动立式压力灭菌器均由上海博讯医疗生物仪器股份有限公司生产；CFX96 荧光定量pcr 仪Bio-Rad、电泳仪及电泳槽Bio-Rad、核酸蛋白分析仪均由美国伯乐生物技术有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 “金花菌”的菌落数量

将15 组茶叶样品分别编号为G1～G15，按照《紧压茶 第3 部分：茯砖茶》（GB/T 9833.3—2013）[7]、《黑 茶 第5 部 分：茯 茶》（GB/T 32719.5—2018）[8]中规定的冠突散囊菌按《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）[9]进行检测计数，具体步骤和方法如下。

称取25 g样品→加入225 mL无菌生理盐水→充分振摇，拍击式均质器均质2 min→10倍系列梯度稀释→每个稀释度2个无菌平皿，分别加入1 mL稀释液→倾注20～25 mL 的孟加拉红琼脂→28 ℃培养5 d→菌落计数。

1.2.2 “金花菌”的DNA提取及方法优化

传统真菌DNA 提取方法需要刮取真菌菌丝，液氮研磨，费事费力；而选择某些商业试剂盒提取DNA又耗时长，提取效果不佳，经过筛选，本试验选用细菌真菌直接裂解液进行提取。但在实验中按照DNA提取试剂盒使用说明书进行时，出现DNA提取失败现象，因此对于试验步骤进行优化，设计2 组不同培养时间对照试验，通过PCR电泳结果筛选出一种适合的“金花菌”DNA快速提取的方法。

处理1：15 组样品，按照GB 4789.15—2016标准方法培养5 d（120 h）后，使用细菌真菌直接裂解液试剂盒，取50 μL细菌真菌直接裂解液于灭菌的Micortube中，用灭菌枪头挑取单菌落，置于Micortube中搅动几下后取出，80 ℃热变形15 min，5 000 r/min离心15 min，取1～5 μL裂解后上清液作为PCR反应模板。

处理2：15 组样品，按GB 4789.15—2016 方法培养3 d（72 h）后，使用细菌真菌直接裂解液试剂盒，剩余步骤同处理1。

1.2.3 “金花菌”系统发育树构建

ITS 通用引物序列对于提取15 组“金花菌”进行PCR 反应，PCR 产物送至上海生工生物技术有限公司测序，并在NCBI 网站Blastn 比对分析，根据同源性最高的比对序列，了解此次“金花菌”中优势散囊菌种群分类，然后用MEGA7软件构建系统发育树，了解其亲缘性。

PCR 反应扩增体系：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3'） 和ITS4 （5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），预混液使用Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）体系，反应体系总体积25 μL（12.5 μL Premix TaqTM、2 μL 样品提取

DNA、0.5 μL ITS1、0.5 μL ITS4、9.5 μLddH2O）。

PCR 反应条件程序为：94 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30 次，最后72 ℃延伸8 min 后得PCR 产物。扩增结束后的PCR产物进行凝胶电泳查看DNA提取及扩增效果。然后将其送至上海生工生物技术有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 “金花菌”菌落数量及ITS测序分析菌群范围

“金花菌”菌落数量根据GB 4789.15—2016检测方法检验结果及ITS 测序分析鉴定，通过NCBI网站Blastn 比对分析[10]，同源性前20 组的序列进行比对，得出子囊菌纲，曲霉菌属，及“金花菌”鉴定优势菌群范围。此次15 组样品ITS 序列在NCBI数据库进行比对，显示该菌ITS序列与蒙地曲霉(Ascomycetes montevidensis）、阿姆斯特丹曲霉（Ascomycetes amstelodami）、赤曲霉（Ascomycetes ruber）、谢瓦曲霉（Ascomycetes chevalieri）、冠突曲霉（Ascomycetes cristatum）、雪花曲霉（Ascomycetes niveoglaucus）具有极高的同源性，且期望值均为0。ITS 序列分析对于“金花菌”只能鉴别到曲霉菌属，子囊菌纲。试验表明此次试验的15组“金花菌”中优势菌种为6种。

“金花菌”的菌落形态在孟加拉红琼脂上培养120 h 后，菌株周围呈金黄色，中心变为黑色（图1）。

图1 “金花菌”孟加拉红琼脂培养120 h生长图

从“金花菌”的菌落数量（表1）可知，15组样品中生产日期最早的G11为2012年1月压制，其菌落数量1.4×106CFU/g；生产日期最晚的G5为2021年4月压制，其菌落数量为3.5×105CFU/g，均超过其产品标准规定的≥20×104CFU/g，表明“金花菌”在合适的储存环境下，其菌落数量较为稳定，对生长环境要求不高，适合长期保存。比较同一厂家不同年份生产的茶叶金花菌数量，G2和G11 为贵州FJ 茶叶有限公司间隔约8年生产的茶叶，其“金花菌”数量均超过标准规定值的5倍以上，表明该公司发花工艺稳定、成熟；G7和G13为镇宁自治县JP农产品开发有限公司间隔约1年生产且至今年份较近的产品，其“金花菌”数量未达到产品标准规定，生产工艺需改进。

表1 测试样品ITSq测序分析菌落鉴定结果

2.2 “金花菌”DNA提取及扩增效果

由1.2.2不同培养时间对照试验的PCR电泳结果可知，培养时间为120 h 的处理1 无电泳条带（图2），表示DNA 提取失败；处理2 条带清晰明显（图3），表示DNA提取成功，方法优化的效果较好。对15 组“金花菌”菌落使用处理2 即优化后的DNA提取方法提取DNA，使用核酸蛋白分析仪测定其纯度，其在吸光度OD260/OD280的比值为1.6～1.9 之间，以及PCR 产物凝胶电泳查看DNA 提取和扩增效果。自左向右G1～G15，由电泳图可知目的条带大小约为500 bp，条带清晰明显，DNA提取及扩增效果良好。由此验证出一种快速提取“金花菌”DNA的方法，选用细菌真菌裂解液，控制菌株生长时间，在孟加拉红琼脂上，培养72 h 最佳，通过接种环刮取菌丝，至裂解液中，最快20 min提取DNA成功，节约大量时间。

图2 金花菌培养120 h后DNA提取及扩增效果凝胶电泳图

图3 金花菌培养72 h后DNA提取及扩增效果凝胶电泳图

2.3 “金花菌”系统发育树构建

对G1～G15 共15 组边销茶茶样中“金花菌”的测序结果通过NCBI 分析选取Score 最高、同源性最大的1组。G1～G15的ITS序列比对结果如表2，据比对结果构建系统发育树，知晓15 组边销茶的亲缘性。对不同产地及不同年份出厂的茶叶中“金花菌”有预估性了解，对“发花”生产工艺所产生的“金花菌”菌群稳定性有所掌握。

以表2 中同源性最高的鉴定结果构建系统发育树，由图4 可见，此次筛选的15 组样品，主要分为3 个分支。每个分支上遗传距离极为接近，而G12 和G5，G2 和G11，G4 和G10 均属于同一厂家不同年份生产的边销茶，都聚集在同一分支上，表示这些厂家的生产工艺比较稳定。G1为外省公司生产的边销茶和本省4 家公司的产品在同一分支上，表明边销茶中“金花菌”通过自然发花方式生产，其菌群比较稳定，优势菌群明显。

图4 15株“金花菌”基于ITS序列比对Score最高的构建系统发育树

表2 同源性及分值最高的ITS序列比对结果

3 小结与讨论

ITS序列分析广泛应用于真菌的鉴定，但是对于“金花菌”只能鉴定到散囊菌属，对于下一步鉴定到种还需要结合其他鉴定手段。如真菌学中的形态分类学以孢子形态和子实体特征为主要分类依据，同时结合电子显微镜观察菌丝的结构、生态等特征；也可以进行多基因系统发育分析或全基因分析。此次ITS序列分析对于15组测试样品比对分析后，得出优势菌群范围为Ascomycetes montevidensis、Ascomycetes amstelodami、Ascomycetes ruber、Ascomycetes chevalieri、Ascomycetes cristatum、Ascomycetes niveoglaucus6种。

“金花菌”作为茯砖茶和黑砖茶等的一个特有的标志性特征，其菌落数量是衡量这一特征的关键性指标，生产工艺的稳定和成熟与否与该指标存在极大关系。本次试验中，同一厂家相隔8年生产的G2和G11两个茶样“金花菌”是标准规定值的5 倍以上；15 组试验茶叶据今生产日期最近的至少有2年时间，其中有7组茶叶“金花菌”数量均超过标准规定值，表明在合适的储存条件下，“金花菌”数量保持一定的稳定性，下降趋势不明显。对于“金花菌”菌落数量的检验是必不可少的，在“金花菌”菌落数量试验过程中，发现制样环节也极为重要，应使用均质器充分震荡摇匀，否则结果出入较大。

此次研究中也优化出一种快速提取“金花菌”DNA的方法，可以缩短提取时间，且提取效果良好。在此提取过程中一定要控制“金花菌”的培养时间，培养时间过长，易导致菌生长老化，使用试剂盒不易裂解其真菌细胞壁，导致其DNA提取失败。因此培养时间选用72 h为宜，配合试剂盒操作方法，可以快速提取该菌DNA，为后续开展“金花菌”的分子生物学研究提供一定的技术基础。