包膜蛋氨酸对松浦镜鲤生长性能、肠道消化酶和肌肉氨基酸组成的影响

2022-10-31赵静怡徐奇友

饲料工业 2022年20期

■赵静怡杨欣徐奇友

（湖州师范学院生命科学学院，水生动物繁育与营养国家地方联合工程实验室，浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，浙江湖州 313000）

随着水产养殖行业的快速发展，鱼粉的需求量和价格急剧攀升。为降低饲料成本，在饲料配方中愈来愈多使用价格低廉的植物蛋白替代鱼粉。蛋氨酸（Met）是豆粕、花生粕、次粉、玉米蛋白粉等植物蛋白源的限制性氨基酸[1]，随着植物蛋白源添加水平的提高，饲料中的氨基酸组成的不平衡越来越明显，Met缺乏会影响蛋白质在鱼体中的转化效率，进而抑制生长[2-3]。因此在提高植物蛋白源添加量的同时，为了保证水产动物的生长性能，在配方中添加外源Met来满足水产动物的需求。

在水产动物饲料中添加Met 的主要形式有：LMet、DL-Met及蛋氨酸羟基类似物[4-7]。但是晶体氨基酸的效果因鱼种类不同呈现差异较大。鲑鳟鱼可以有效利用晶体Met[8-9]，鲤鱼（Cyprinus carpio）、鲫鱼（Carassiusauratus gibelio）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[10-12]不能有效利用外源性晶体氨基酸，主要原因推测为晶体氨基酸在无胃鱼的肠道中吸收过快，不能与来自饲料内的氨基酸同步吸收，从而导致利用效果不佳。对晶体氨基酸进行缓释处理（包膜或微胶囊）可以提高晶体氨基酸的有效利用。已有研究表明，稳定化处理的Met 可以显著提高建鲤肠道和肝胰脏的胰蛋白酶活性和脂肪酶活性[13]。作为蛋白质翻译的初始氨基酸，Met是控制蛋白质合成代谢的限速氨基酸[14-15]。消化及代谢的改变会影响蛋白质、脂肪和碳水化合物在机体内的沉积。已有研究表明，在鲤机体内，Met多用于营养物质的储备，其水平对鲤鱼肌肉中7种氨基酸的合成有显著影响[16]。水产动物肌肉氨基酸含量影响着水产动物的生命活动，同时鱼类作为食品也影响着人体必需氨基酸的摄入。因此，本试验旨在探究包膜Met对松浦镜鲤生长性能、肠道消化酶活性和肌肉氨基酸组成的影响，为进一步探索包膜和晶体Met在鲤鱼饲料中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

本试验使用市售晶体DL-Met，包膜DL-Met 为实验室自制。根据鲤鱼营养需要[17]，以鱼粉、棉粕、菜籽粕和豆粕为蛋白源，以鱼油、豆油、大豆磷脂为脂肪源配制成基础饲料。以本课题组前期对鲤鱼Met需求量研究（Met 为0.90%）为基础[18]，本试验对照组中添加0.4%晶体Met，试验组中分别添加0、0.2%和0.4%包膜Met（B0、B2、B4 组），配制成4 种等氮等脂饲料。Met 的实际含量分别为0.96%、0.56%、0.75%和0.92%。将饲料原料过60 目筛，矿物质预混料过80 目筛，按比例称重后依次混匀，加入约20%水充分混匀，使用制粒机制成直径3 mm 饲料颗粒，风干机常温风干，贮存于-20 ℃冰箱。试验饲料配方及营养水平见表1。

表1 饲料配方及营养水平

1.2 试验设计与饲养管理

使用室外循环水系统进行养殖试验，养殖桶装水量为500 L。试验用鱼为松浦镜鲤，自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所购入，试验开始前驯化2周。挑选360 尾规格整齐、体质健壮的松浦镜鲤幼鱼，体重（8.25±0.78）g，随机放养在12 个养殖桶中，随机选取每3 个养殖桶为1 个试验组。每天人工投饲3 次（8：30、12：30、17：30），以饱食投喂。试验期间，定期更换曝气自来水，清洁养殖桶，保持水质稳定，水温为24～29 ℃，溶氧5.0～8.0 mg/L，亚硝酸盐＜0.05 mg/L，氨氮＜0.1 mg/L，养殖期为8周。

1.3 样品采集与指标测定

养殖期结束后，对每个养殖桶内的鱼计数、称重，用于计算增重率（weight gain rate，WGR）、特定生长率（specific growth rate，SGR）、饲料系数（feed conversion ratio，FCR）和蛋白质效率（protein efficiency ratio，PER）。在每个养殖桶中随机挑选16 尾鱼，使用MS-222（100 mg/L）麻醉后，其中4尾鱼用于全鱼营养成分测定。采用直接干燥法（GB/T 6435—2014）测定全鱼和饲料水分含量；杜马斯定氮仪测定粗蛋白含量；索氏抽提法（GB/T 6433—2006）测定粗脂肪含量；马弗炉灼烧法（GB/T 6438—2007）测定粗灰分含量；干物质含量通过水分含量计算得出。

另取12 尾鱼放置于冰盘上解剖，取下左右侧背肌，同时迅速取出内脏团，将肠道分离。每4 尾鱼的肌肉和肠道混为1 个样品，肠道和肌肉样品贮存于-20 ℃用以测量肠道消化酶活性和肌肉氨基酸含量。将肠道的组织样品用0.86%生理盐水制成10%的组织匀浆液，2 500 r/min 离心取上清液后，分装于2 mL 离心管存于-20 ℃冰箱中备用。肠道的胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所有限公司提供的试剂盒，并通过UV-3200紫外分光光度计测定。

肌肉氨基酸含量采用酸水解法：将肌肉鲜样品捣碎制成肉糜，称取200 mg样品，加6 mol/L盐酸溶液在110 ℃条件下水解24 h后，转移至50 mL容量瓶定容，取2 mL离心后，取200 μL上清液，使用氮吹仪吹干后加入2 mL 0.02 mol/L 盐酸溶液并混匀，使用0.22 μm针式滤膜过滤后，取1 mL 于进样瓶中，通过日立L-8900氨基酸分析仪测定。

1.4 计算公式

WGR（%）＝[（Wt-W0）/W0]×100

SGR（%/d）=100×（lnWt-lnW0）/d

FCR=Wf/（Wt-W0）

PER=（Wt-W0）/（Wf×Pf）

必需氨基酸指数（EAAI）=（a/A×b/B×……×i/I）（1/n）

式中:Wt——试验末鱼重（g）；

W0——初始鱼重（g）；

Wf——饲料摄取量（g）；

Pf——饲料蛋白质含量（%）；

n——必需氨基酸数量；

a、b、…、i——松浦镜鲤肌肉中必需氨基酸含量（mg/g）；

A、B、…、I——标准蛋白质必需氨基酸含量[19]（mg/g）；

d——试验天数。

1.5 统计分析

使用IBM SPSS Statistics 25.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncan’s 法进行多重比较，以P＜0.05 为显著性差异标准，试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 包膜Met对松浦镜鲤生长性能的影响（见表2）

如表2所示，与对照组相比，B2、B4组的特定生长率、增重率、蛋白质效率和饲料系数均没有显著性差异（P＞0.05），B0 组的增重率和蛋白质效率显著降低（P＜0.05），饲料系数显著增加（P＜0.05），特定生长率没有显著性差异（P＞0.05）。B2组和B4组之间的增重率、特定生长率、饲料系数和蛋白质效率没有显著性差异（P＜0.05）。与B2组和B4组相比，B0组的饲料系数显著提高（P＜0.05），特定生长率、增重率和蛋白质效率显著降低（P＜0.05）。

2.2 包膜Met对松浦镜鲤体成分的影响（见表3）

表3 包膜Met对松浦镜鲤体成分的影响(%)

如表3所示，松浦镜鲤的水分、粗脂肪、粗灰分含量在各组间均无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，B2组的粗蛋白显著降低（P＜0.05），B0组和B4组无显著差异（P＞0.05），但B4 组的鱼体粗蛋白含量显著高于B2组和B0组（P＜0.05）。

2.3 包膜Met对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响（见表4）

如表4 所示，胰蛋白酶活性各组间无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，B0 组的淀粉酶活性显著升高（P＜0.05）。随包膜Met 添加量的增加，淀粉酶活性逐渐降低，B4 组与对照组相比无显著差异（P＞0.05），但显著低于B0 组（P＜0.05）。B4 组的脂肪酶活性显著高于对照组（P＜0.05），B0、B2 组较对照组无显著差异。

表4 包膜Met对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响

2.4 包膜Met对松浦镜鲤肌肉氨基酸组成的影响（见表5）

如表5所示，在松浦镜鲤肌肉中共检测出17种氨基酸，包括9种鱼类必需氨基酸和8种非必需氨基酸，未检测色氨酸。各组间肌肉必需氨基酸、非必需氨基酸、总氨基酸含量以及必需氨基酸指数均无显著差异（P＞0.05），但随包膜Met添加量的增加，肌肉中总必需氨基酸、必需氨基酸指数、总非必需氨基酸和总氨基酸含量呈增加的趋势。

表5 包膜Met对松浦镜鲤肌肉氨基酸含量的影响(湿重基础，mg/g)

3 讨论

3.1 包膜Met对松浦镜鲤生长性能的影响

近年来，Met作为信号分子，调节动物生长和代谢的作用已在体外和体内的试验得到广泛证明[20-21]。一些研究表明，饲料中缺乏Met会导致细胞生理和功能失调[22-23]。作为膳食营养素传感器的营养感应信号通路在控制身体生长性能方面起着至关重要的作用[24]。Met可以激活鱼类生长激素胰岛素样生长因子信号通路，上调雷帕霉素靶蛋白，抑制氨基酸反应信号，从而提高营养代谢水平，提高生长性能。在本试验中，与饲喂0.4%晶体Met 饲料的鲤鱼相比，饲喂未添加Met饲料的鲤鱼增重率、蛋白质效率显著降低，饲料系数显著提高，这与大口黑鲈（Micropterus salmoides）[25]和军曹鱼（Rachycentron canadum）[26]喂食限制性Met 饲料的特定生长率、增重率、蛋白质效率显著降低的研究结果一致。饲喂0.2%和0.4%包膜Met 饲料的鲤鱼的增重率、特定生长率、蛋白质效率和饲料系数无显著差异，但0.2%包膜Met组的增重率有升高趋势。这与关于肥育蓝斑鲶（Astyanax altiparanae）[27]、非洲鲶鱼（Clarias gariepinus）[28]、军曹鱼[29]的研究一致，进一步证实了Met 对鱼类生长性能的重要调节作用。本试验中，对照组即0.4%晶体Met组，与0.2%和0.4%包膜Met组的增重率、蛋白质效率和饲料系数均无显著差异，特定生长率略低于0.2%包膜Met组，无显著差异。这说明在本试验中，0.4%晶体Met对鲤鱼生长性能的影响可达到0.2%包膜Met的水平。这与陈丙爱等[10]在鲤鱼试验中饲喂晶体Met 饲料组的增重率略低于饲喂同水平包膜Met饲料组，且无显著差异的研究结果一致。

本试验中采用饱食投喂，此外，饲料长时间留存于养殖桶底部，可能造成了饲料在水中部分溶失，从而导致饲料系数整体过高。与0.4%晶体Met组相比，未添加Met 组显著提高了饲料系数，由此可见，鲤鱼可以利用饲料中晶体氨基酸提高其生长性能，但对包膜Met的利用效果更优，0.2%包膜Met可达到0.4%晶体Met的水平。

3.2 包膜蛋氨酸对松浦镜鲤体组成的影响

Met 作为必需氨基酸，它不但是参与蛋白质合成的基石，也是参与调节新陈代谢、免疫和生殖的信号分子[30]。Met 参与调节IGF-Ⅰ和氨基酸转运蛋白mRNA 的表达[31-33]，调节TOR 信号通路，影响虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）[34-35]和大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）[36]肌肉蛋白质的合成。张满隆等[37]的研究表明，低鱼粉饲料中添加0.25%Met，与未添加组相比，鲫鱼全鱼粗蛋白略提高，粗脂肪略降低。冷向军等[38]的研究表明，晶体Met 对罗非鱼（Oreochromis mossambicus）的肌肉水分含量有降低趋势，晶体Met 和包膜Met均显著降低了肌肉粗脂肪含量。程龙等[18]的研究表明Met显著降低了松浦镜鲤肌肉水分含量，提高了肌肉粗蛋白含量。本试验研究表明，0.4%晶体氨基酸组鱼体的水分含量最低，随着包膜Met 添加量的增加，松浦镜鲤鱼体水分含量呈现下降趋势，这与冷向军等[38]在罗非鱼、陈丙爱等[10]在鲤鱼上的研究结果一致。与不添加包膜或晶体Met及添加0.2%包膜Met组相比，饲料中添加0.4%包膜Met显著提高松浦镜鲤幼鱼的粗蛋白含量，这与程龙等[18]在松浦镜鲤上的研究结果一致，体成分分析和生长性能均证明鲤鱼可以利用晶体Met，但包膜Met的利用效果优于晶体Met。

3.3 包膜蛋氨酸对松浦镜鲤肠道消化酶活性的影响

饲料中Met缺乏会显著降低鱼类的生长性能，使得饲料利用率下降[39]，而饲料利用率低下可能由于鱼类肠道中饲料的消化效率低导致的，这取决于鱼类的消化和吸收能力。消化酶包括胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，其活性对肠道消化和吸收能力有重要影响[40]。大量研究表明Met 可以提高消化酶活性从而促进鱼类生长。段晶等[41]研究表明，随着Met添加量增加，洛氏鱥（Rhynchocypris lagowskii）前、中、后肠和肝胰腺中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力均呈先升高后降低的趋势。而缓释处理的Met与晶体Met相比对肠道消化能力具有更强的促进作用。彭艳等[13]研究表明，稳定化处理的Met较未稳定化处理的Met显著提高了建鲤肠道和肝胰脏的胰蛋白酶活性和脂肪酶活性。本试验中，各组胰蛋白酶活性无显著差异。随着Met水平的提高，脂肪酶活性不断提高，且同等水平下包膜Met的脂肪酶活性显著高于晶体Met。本试验中不添加Met 显著提高了肠道淀粉酶活性，且随着Met 水平上升，淀粉酶活性呈下降趋势。这与段晶等[41]、程龙[42]的结果相一致，高剂量添加Met 导致淀粉酶活性下降。淀粉酶是嗜酸性酶，推测Met添加量可能影响了肠道pH，有待进一步研究。

3.4 包膜蛋氨酸对松浦镜鲤肌肉氨基酸组成的影响

Met 摄入量在鱼体内除影响营养物质的积累外，对于确保甲基化反应中活性甲基的高合成也必不可少。对大西洋鲑（Salmo salar）[43]的研究表明，随着Met摄入量的提高，肝脏转硫率提高，牛磺酸的产量上升，使得各水平Met组肝脏中的游离Met保持恒定。本试验中背肌水解氨基酸均无显著差异，推测由于Met摄入量相差范围较小，鲤鱼体内通过提升转硫率，牛磺酸的产量上升，游离Met 保持恒定，导致在鲤鱼背肌中的氨基酸沉积无显著差异。人体的必需氨基酸包括赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等8种。在本试验中，鲤鱼背肌中的该8种氨基酸均随Met水平升高而呈上升趋势，各组必需氨基酸指数无显著差异，且均大于0.95[44]，证明松浦镜鲤是优质蛋白食物。

除酪氨酸外，各氨基酸含量均随Met水平升高而升高，而0.4%包膜Met 组的酪氨酸含量较0.2%包膜Met 组有下降趋势，无显著差异。张玲等[16]在鲤鱼上的研究中也得到了相似的结果，即肌肉中的氨基酸含量随Met 水平升高呈现先升高再下降的趋势。推测在满足肌肉蛋白质合成后，进一步提高Met添加量可能会导致氨基酸平衡被破坏，致使其他氨基酸在肌肉中的合成利用下降[45-46]。由于本试验Met添加量变化范围与鲤鱼实际Met需求量相差不大，因此未产生显著差异。