鼠李糖乳杆菌对加州鲈生理特性与肠道菌群的影响

2022-10-31卢俊桦蔡春静

饲料工业 2022年20期

■卢俊桦蔡春静李璇袁雪王莹楚杰

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所，山东济南 250103）

益生菌是通过定植在人体和动物体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道菌群平衡，促进营养吸收，保持肠道健康，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物[1-2]。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点[3-4]。鼠李糖乳杆菌是人类共生微生物群中的一员，已被证明对人类健康很重要，如平衡肠道的微生态系统，并提供局部和系统的免疫调节[5]。鼠李糖乳杆菌可以耐受动物消化道内的环境，在人和动物的肠道中定植，并可以改善宿主的系统免疫反应[6]。

加州鲈，又称大口黑鲈（Micropterus salmoides），具有适应能力强、生长迅速、饲养管理方便等优点，可在淡水池塘、湖泊、水库等中开展养殖，是一种优良的水产养殖品种。其肉质鲜美，适温较广，经济价值较高，养殖难度适中，适宜在北方地区进行推广养殖。近几年来，大口黑鲈养殖产量逐年升高，已成为重要的淡水名特优养殖品种之一[7-8]。随着水产养殖环境的恶化和常见病害的影响，如何通过饲料营养来维持养殖鱼的生理健康，提高免疫防御能力是一个重要的技术问题。本着“预防为主，防重于治”的原则，通过添加益生菌调节机体中过度繁殖菌群的活性，改变机体消化道的内环境，从而保持肠道内菌群的平衡,促进机体肠道健康[9-10]。因此，本研究旨在探究不同鼠李糖乳杆菌的添加量对加州鲈生长性能、免疫指标、抗氧化能力、肠道消化酶活性和肠道菌群的影响。本研究将为鼠李糖乳杆菌在水产养殖业的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

加州鲈购自山东省淡水渔业研究院；鼠李糖乳杆菌由山东省科学院生物研究所工业微生物研究室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

试验选择初始体重（83.8±9.6）g、健康的加州鲈240尾，设置对照组和3个试验组，分别用D组、R1组、R2组和R3组表示，每组3个重复。每个饲养容器（规格为半径1 m、高1 m）投放20尾加州鲈。D组为空白对照组饲喂基础饲料，试验R1、R2、R3组在基础饲料中分别添加2%、5%、8%的鼠李糖乳杆菌（1×109CFU/g）。投喂前，将菌液均匀地喷洒在颗粒饲料表面。试验期为42 d。基础饲料组成及营养水平见表1。

表1 基础饲料组成及营养水平(%)

1.2.2 饲养管理

试验鱼在试验开始前用基础饲料驯化2周。养殖期间按照加州鲈体重的3%投喂饲料，每天两次（8：00、18：00），表观饱食投喂。每个饲养容器都是由两个气石连接到一个电动压缩机组成的。每周测量每个水箱的水质参数，水温为（26.0±3.0）℃，溶解氧含量约（6.5±0.3）mg/L，水体pH为（7.3±0.6），氨氮浓度≤0.21 mg/L。

1.2.3 生长性能指标的测定

试验结束后对加州鲈进行计数和体重测定，计算生长性能指标。

增重率（WGR，%）=[（Mt-Mo）/Mo]×100

特定生长率（SGR，%/d）=[（lnMt-lnMo）/t]×100

成活率（SR，%）=Nt/No×100

饲料系数=总投饵量/加州鲈总增重量

式中：No——加州鲈初始个体数量（尾）；

Nt——加州鲈终末个体数量（尾）；

Mo——加州鲈初重（g）；

Mt——加州鲈末重（g）；

t——试验天数（d）。

1.2.4 样品处理

取各试验组加州鲈血液样品于离心管中，放入冰盒中保存。血样2 000～3 000 r/min离心20 min，收集上清液，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

加州鲈取血后处死，解剖，摘取肝脏、肠道，用无菌的生理盐水清洗并用吸水纸擦干表面多余水分，用液氮快速冷冻后保存。准确称取组织重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，在冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液，用于蛋白质含量及酶活性测定。

1.2.5 血清免疫指标

血清中酸性磷酸酶（ACP）的活性采用比色法测定（南京建成生物工程研究所有限公司）。白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的浓度采用酶联免疫检测试剂盒测定（南京建成生物工程研究所有限公司）。一个金氏单位的ACP活性被定义为在37 ℃下与基质作用30 min产生1 mg硝基苯酚的100 mL血清中所需的酶的量。

1.2.6 抗氧化相关参数测定

用分光光度计测定肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性和丙二醛（MDA）含量。抗氧化相关参数检测试剂盒（SOD、GSH-Px、CAT、GPT、GOT、MDA）购自南京建成生物工程研究所有限公司。一个SOD 活性单位（U）定义：在450 nm 处反应体系中SOD 抑制率达50%时所对应的酶量。一个单位的GSH-Px 活性定义：每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1 mol/L为一个酶活性单位。组织中CAT活性定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量为一个活性单位。卡门氏单位定义：1 mL液体，反应液总容量3 mL，波长340 nm，1 cm 光径，25 ℃，1 min 内所生成的丙酮酸，使NADH 氧化成NAD+而引起吸光度每下降0.001 为一个单位（1 卡门氏单位=0.482 IU/L，25 ℃）。MDA 含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）的测定程序。将样品（0.1 mL）与相同体积的试剂一混匀，加入3.0 mL试剂二和1.0 mL试剂三。将试剂与样品的混合物在沸水浴中加热40 min，然后冷却，以4 000 r/min离心10 min，以去除组织样品的沉淀。上清液中的MDA含量可以直接从粉红色色素的摩尔消光系数来确定。

1.2.7 消化酶活性测定

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。组织匀浆中胰蛋白酶活性单位定义：在pH 8.0，37 ℃条件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为一个酶活性单位。组织中淀粉酶活性单位定义：组织中每毫克蛋白质在37 ℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活性单位。组织脂肪酶活性单位定义：在37 ℃条件下，每克组织蛋白质在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个酶活性单位。

1.2.8 肠道菌群分析

养殖结束后禁食24 h，每组随机选取5 尾加州鲈。采用75%的乙醇擦拭消毒，无菌操作条件下解剖取出完整肠道，送至深圳微科盟科技有限公司进行16S rRNA测序分析。

1.3 数据统计与分析

试验采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，数据结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌对加州鲈生长性能的影响（见表2）

表2 鼠李糖乳杆菌对加州鲈生长性能的影响

由表2可知，饲料中添加鼠李糖乳杆菌能够明显提高加州鲈的增重率、特定生长率和养殖成活率，明显降低饲料系数。

2.2 鼠李糖乳杆菌对加州鲈血清免疫指标的影响（见表3）

由表3可知，饲料中添加鼠李糖乳杆菌对加州鲈血清IL-6 含量影响不显著（P＞0.05），对加州鲈血清ACP活性、TNF-α含量有影响。与D组相比，试验R2、R3 组的ACP 活性显著升高，分别增加72.54%和91.20%；饲料中随着鼠李糖乳杆菌添加量的增加，各组血清IL-6含量缓慢升高，血清TNF-α含量变化规律不明显，但试验R3组TNF-α含量显著高于D组。

表3 鼠李糖乳杆菌对加州鲈血清免疫指标的影响

2.3 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肝脏抗氧化指标的影响（见表4）

由表4可知，饲料中添加鼠李糖乳杆菌对加州鲈肝脏SOD、MDA、CAT、GPT、GOT、GSH-Px有不同程度的影响。与D组相比，试验R1、R2、R3组的SOD活性显著升高（P＜0.05），分别增加6.61%、15.91%和25.66%；饲料中随着鼠李糖乳杆菌添加量的增加，MDA 含量逐渐下降，与D 组相比，试验R3 组的MDA含量减少26.26%（P＜0.05）；试验R2、R3 组显著增加加州鲈肝脏CAT 活性（P＜0.05），与D 组相比，R2、R3组分别增加20.46%和40.37%；随着饲料中鼠李糖乳杆菌添加量的增加，GPT、GOT活性下降，与D组相比，试验R2、R3组GPT活性分别下降17.70%、22.59%，差异显著（P＜0.05），试验R1、R2、R3组GOT 活性分别下降25.31%、48.32%、46.57%，差异显著（P＜0.05）；随着饲料中鼠李糖乳杆菌添加量的增加，各组加州鲈肝脏GSH-Px 活性显著升高（P＜0.05），分别增加7.59%、17.74%和22.76%。

表4 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肝脏抗氧化指标的影响

2.4 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肠道消化酶活性的影响（见表5）

由表5可知，饲料中添加鼠李糖乳杆菌对加州鲈肠道消化酶有不同程度的影响。与D 组相比，试验R1、R2、R3 组的淀粉酶活性显著升高（P＜0.05），分别增加17.24%、34.48%和48.27%；饲料中随着鼠李糖乳杆菌添加量的增加，蛋白酶和脂肪酶的活性也显著升高，与D组相比，试验R1、R2、R3组的蛋白酶活性分别增加9.45%、24.63%和49.95%；试验R1、R2、R3 组的脂肪酶活性分别增加28.57%、48.98%和81.63%。

表5 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肠道消化酶活性的影响

2.5 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肠道菌群组成的影响

基于Illumina NovaSeq 平台对不同处理组加州鲈肠道菌群组成进行分析比较。

2.5.1 不同处理组加州鲈肠道菌群的OTUs 韦恩图（见图1）

图1 不同处理组加州鲈肠道菌群的OTUs韦恩图

对于样本间，根据OTU是否存在来寻找样本之间的特有或共有的OTU，通过韦恩图(Venn diagram)分析不同样品组之间特有或共有的OTU，用于统计多个样本中所共有和独有的OTU数目，可以比较直观地表现样本在OTU水平上的组成相似性及重叠情况[11-12]。由图1可知，与D组相比，R1组加州鲈肠道具有3 534个特有OTU（D组1 222个），R2组加州鲈肠道具有2 880个特有OTU（D组1 155个），R3组加州鲈肠道具有3 512个特有OTU（D组1 288个）。可见，饲料中添加鼠李糖乳杆菌后，加州鲈肠道中特有的OTU数明显增多。

2.5.2 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肠道菌群物种相对丰度的影响（见图2）

将注释结果在不同分类水平上按照丰度进行排序，选取每个组别在属分类水平上最大丰度排名前20的物种，生成物种相对丰度柱形图。由图2 可知，对照组加州鲈肠道鲸杆菌属（Cetobacterium）相对丰度最大为52.42% ，罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、支原体属（Mycoplasma）和假单胞菌属（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）的相对丰度分别为15.13%、8.30%和5.53%，其他菌属（Others）为18.62%；R1组加州鲈肠道支原体属（Mycoplasma）、鲸杆菌属（Cetobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）和罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）的相对丰度分别为27.75%、20.29%、13.83%、12.58%，其他菌属为25.55%；R2 组加州鲈肠道的罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、支原体属（Mycoplasma）、鲸杆菌属（Cetobacterium）和假单胞菌属（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）的相对丰度分别为27.14%、23.38%、13.91%和8.75%，其他菌属为26.82%；R3 组加州鲈肠道的支原体属（Mycoplasma）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、假单胞菌属（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）和鲸杆菌属（Cetobacterium）的相对丰度分别为28.20%、25.01%、17.14%和6.14%，其他菌属为23.51%。鼠李糖乳杆菌组加州鲈肠道其他菌属的相对丰度均高于D组。

图2 不同处理组加州鲈肠道菌群中属水平以上的物种相对丰度柱形图

2.5.3 鼠李糖乳杆菌对加州鲈肠道菌群α-多样性指数的影响（见表6）

表6 不同处理组加州鲈肠道菌群α-多样性指数比较

由表6 可知，处理组加州鲈肠道菌群Shannon、Simpson、Chao 1 指数、faith 指数均明显高于D 组。添加鼠李糖乳杆菌能够明显提高加州鲈肠道菌群的多样性水平。

3 讨论

血清中的酸性磷酸酶是溶酶体酶系的标志酶，能够转移磷酸基团，合成磷酸二腺苷和磷酸三腺苷，参与能量转化和信号传导，进而提高机体非特异性免疫水平和营养代谢水平[13]。TNF-α是由淋巴细胞和巨噬细胞分泌的一种重要的免疫调节因子，它能够激活巨噬细胞，促进T、B淋巴细胞的增殖分化，促进某些细胞产生白细胞介素、干扰素以及TNF-α等细胞因子，发挥重要的免疫促进作用[14]。IL-6形成于免疫反应早期，在机体免疫应激中起主导作用[15]。本试验研究表明，随着饲料中鼠李糖乳杆菌添加水平的增加，加州鲈血清中酸性磷酸酶活性逐渐增高，试验R2、R3组显著高于D组（P＜0.05）；血清中TNF-α的含量无明显变化规律，试验R3组显著高于D组（P＜0.05）；血清中IL-6的含量增高，试验R1、R2、R3组均高于D组（P＞0.05）。张羽[16]研究表明，鼠李糖乳杆菌能够提高宿主免疫力，它能够调节斑马鱼肠道组织免疫因子的表达，提高斑马鱼的攻毒保护率，这与本研究鼠李糖乳杆菌能提高机体免疫力的试验结论是相一致的。这说明饲料中添加适宜鼠李糖乳杆菌可通过促进细胞因子的表达来提高机体的特异性免疫，从而增强机体的抗病能力。

动物机体内存在酶类和非酶类清除机制的抗氧化系统。SOD是重要的抗氧化酶之一，能够清除机体内的自由基，防止生物分子损伤[17]。本试验结果表明，随着鼠李糖乳杆菌添加水平的增加，加州鲈肝脏中SOD的酶活性逐渐增高，试验R1、R2、R3组均显著高于D 组（P＜0.05）；加州鲈肝脏CAT 酶活性逐渐增加，试验R2、R3组均显著高于D组(P＜0.05)；加州鲈肝脏中GSH-Px 的酶活逐渐增加，试验R1、R2、R3 组均显著高于D组（P＜0.05）。黄燕华等[18]研究发现在奥尼罗非鱼的饲料中添加鼠李糖乳杆菌，可以显著提高血清中的抗超氧阴离子自由基能力和溶菌酶活性，提高奥尼罗非鱼免疫、抗氧化能力，因此本研究结论也证实了鼠李糖乳杆菌能提高机体抗氧化能力。MDA是脂质过氧化物反应的最终产物，MDA 的含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[19]。本试验结果显示，随着饲料中鼠李糖乳杆菌添加水平的增加，MDA的含量逐渐降低，试验R3组显著低于对照D组（P＜0.05）；加州鲈肝脏GPT活性逐渐降低，试验R2、R3 组显著低于对照D 组（P＜0.05）；加州鲈肝脏GOT 活性逐渐降低，试验R1、R2、R3 组均显著低于D 组（P＜0.05）。周晓波等[20]研究发现在饲料中添加鼠李糖乳杆菌可以显著提高罗非鱼鱼体粗蛋白、血清三酰甘油、葡萄糖含量，显著降GPT活性。这说明在饲料中添加适宜水平的鼠李糖乳杆菌可以提高加州鲈的抗氧化功能，减轻自由基对机体的损伤。

鱼类对食物消化与吸收主要靠肠道消化酶的消化，鱼类肠道消化酶活性可以在一定程度上反映其消化能力[21-22]。通过消化酶的分泌促进营养物质的消化与吸收，同时提高其饲料的营养价值和营养物质的利用率，从而降低饲料系数，改善鱼体的生长性能。本试验研究表明，试验R1、R2、R3 组的淀粉酶活性、蛋白酶活性和脂肪酶活性均显著高于D 组(P＜0.05)，且试验组加州鲈的增重率、特定生长率和成活率明显高于D组，饲料系数与对照组相比明显降低。李利等[23]研究表明，在饲料中添加乳酸菌制剂可以提高鲤鱼生长性能和肠道淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，与本研究结论相一致，说明鼠李糖乳杆菌的添加可以提高加州鲈的生长性能和肠道消化酶活性。

肠道菌群的组成对机体免疫力、肠道的屏障功能和肠道的消化吸收也有非常重要的作用。有研究表明，鼠李糖乳杆菌能够改变斑马鱼肠道菌群的结构组成，对宿主免疫力具有一定的影响[16]。陈营等[24]在牙鲆稚鱼中投喂鼠李糖乳杆菌P15后，牙鲆肠道中的乳酸菌数上升，且肠道中的弧菌下降明显。