林昊烨，陈淑仪，徐 麟，李 暄，王丙云，陈志胜，刘璨颖，陈胜锋

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528200）

脊髓损伤（SCI）是一种中枢神经系统疾病，常发生于宠物身上，可能引发截瘫、大小便失禁等［1］。髓鞘的完整性对于维持神经元功能至关重要，而SCI 时脊髓轴突发生急性脱髓鞘甚至神经纤维断裂是导致神经功能缺失的重要原因。尽管神经纤维很难再生，但髓鞘可促进轴突末梢的延长以及重建突触联系，因此在SCI治疗中，促进髓鞘的修复进而促进神经功能的改善是SCI治疗的重要环节［2-3］。

犬脂肪间充质干细胞（ADMSCs）具有较强分化能力，能分泌多种细胞因子和炎性趋化因子［4］。研究表明，间充质干细胞（MSC）分离于犬的皮下脂肪组织，具有自我更新潜力，可显著增加脊髓组织髓鞘含量，但机制尚不清楚。髓鞘由胶质细胞和施万细胞组成，且有证据显示SCI 时施万细胞参与髓鞘的修复［5-6］。因此，本试验以RSC96细胞（一种大鼠施万细胞的细胞系）为对象，模拟SCI 时脊髓组织低氧缺糖的微环境，制备低氧缺糖RSC96 细胞模型，通过离体试验研究ADMSCs 对低氧缺糖RSC96 细胞增殖、迁移及相关基因表达的影响，旨在探究MSC 促进髓鞘修复的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 RSC96细胞株（来源于大鼠施万细胞的细胞系）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 主要试剂及耗材 CCK-8 试剂盒，RNA 提取及反转录试剂盒，TB Green PCR Master Mix，96孔qPCR反应试剂盒及qPCR封板膜；6孔及24孔Transwell 共培养板；细胞划痕插件（500 μm 划痕区域）。

1.3 主要仪器 CO2培养箱；低氧培养箱；正置荧光显微镜；离心机；荧光定量PCR 仪（LightCycler480）。

1.4 方法

1.4.1 RSC96 细胞培养 取出冻存RSC96 细胞，37 ℃水浴速溶，1 000 r∕min 离心5 min，弃去冻存液，加入培养基重悬细胞，以1×106cell 密度接种于培养皿。在37℃5% CO2培养箱中培养，2～3d换液，取P3代细胞做后续实验。

1.4.2 犬ADMSCs 培养 本实验室已建立犬ADMSCs 原代细胞的分离及鉴定方法，取出冻存的3～6 代犬ADMSCs 细胞，37 ℃水浴锅速溶，1000r∕min离心5 min，弃去冻存液，加入培养基，以1×106cell的密度接种于培养皿。在37 ℃5% CO2培养箱中培养，2～3 d 换液，取P3 代细胞做后续实验。

1.4.3 RSC96 细胞低氧缺糖模型的建立 取对数生长期RSC96细胞以1×105cell∕孔分别接种到5个24 孔板中，每板设置6 个复孔。其中1 板作为空白对照组常规培养，另4 板作不同造模时长的低氧缺糖模型组细胞板，待细胞长至60%～70%，弃去完全培养基，PBS 洗涤1～2 次，除去多余完全培养基。每孔加入1 mL DMEM 无糖培养基，在37 ℃3% O2和5% CO2低氧培养箱中分别培养造模6、8、10、12 h，用CCK-8 分别检测5 板细胞活性及镜下观察细胞形态。5板细胞皆弃去旧液，每孔加入含10%CCK-8 的DMEM 200 μL，37 ℃暗室孵育30 min，随后转移到96 孔板，测定OD 值。低氧缺糖模型组细胞增殖抑制率为50%左右，代表模型建立成功。细胞增殖抑制率＝（空白对照组-低氧缺糖模型组）∕空白对照组×100%。

1.4.4 犬ADMSCs 对低氧缺糖模型RSC96 细胞增殖的影响 设空白对照组、模型对照组、MSC共培养组及空白培养基组，空白对照组为常规培养的处于对数生长期的RSC96 细胞，其余三组为制备的低氧缺糖模型RSC96 细胞，造模时间为10 h。造模后模型对照组添加RSC96 完全培养基1 mL；MSC 共培养组复孔带Transwell 小室，小室上层以1×105cell∕孔接种犬ADMSCs细胞并加入500 μL干细胞培养基，小室下层加入500 μL RSC96完全培养基；空白培养基组添加500 μL干细胞培养基及500 μL RSC96 完全培养基。24 h后使用CCK-8法检测各组间OD值。

1.4.5 犬ADMSCs 对低氧缺糖模型RSC96 细胞迁移的影响 设置空白对照组、模型对照组、MSC 共培养组和空白培养基组，每组设置3 个复孔，每孔安装1个细胞划痕插件，保证插件紧贴培养板底，在插件两室接种1×104cell∕孔，待细胞铺满后移除划痕插件。3个实验组按照前述方法进行共培养及细胞培养基调整，除空白对照组外3组均进行低氧缺糖造模。分别在造模后0、12、24 h 拍照并计算迁移率。迁移率＝（0 h 划痕面积-目标时间段划痕面积）∕0 h划痕面积×100%。

1.4.6 犬ADMSCs 对低氧缺糖模型RSC96 细胞增殖迁移相关基因表达的影响 取对数生长期RSC96细胞以5×105cell的密度接种到6孔板，分3组且每组设3 个复孔，按照前述方法分组及处理。按照说明书提取各组细胞的RNA，在紫外分光光度计下检测A260∕A280 数值，将所提取合格样品的RNA 按照说明书方法反转录为cDNA，-30 ℃保存。

在NCBI Primer-blast得到NGF、NT-3、Nrg-1和GAPDH（内参）基因的PCR引物序列（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。配置qPCR 反应体系，运行qPCR 反应程序，得到各基因相应Ct 值后，采用相对定量法2-△△Ct计算各基因mRNA表达水平。

表1 PCR引物序列表

1.4.7 数据分析 使用ImageJ 计算细胞迁移面积大小；采用IBM SPSS Statistics 20统计软件进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 为差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 RSC96 细胞形态学观察 正常组RSC96 细胞贴壁生长，形态为不规则神经元状，细胞折光性良好，生长速度较快。低氧缺糖造模后RSC96细胞贴壁生长，细胞折光性变差，细胞扁平伪足延长，细胞颗粒变性，生长速度减缓。

2.2 犬ADMSCs对低氧缺糖模型RSC96细胞增殖的影响 由图1 可知，0 h 时空白对照组OD 值均显著高于其余三组（P＜0.05）；24 h后MSC共培养组OD值显著高于空白培养基组与模型对照组（P＜0.05）。

图1 犬ADMSCs对低氧缺糖模型RSC96细胞增殖的影响

2.3 犬ADMSCs 对低氧缺糖模型RSC96 细胞迁移的影响 由表2 可知，0 h 时4 组间划痕面积无显著差异（P＞0.05）；12 h 时MSC 共培养组与空白对照组的划痕面积显著小于另外两组（P＜0.05）；24 h时空白培养基组的划痕面积显著大于空白对照组（P＜0.05），空白培养基组的划痕面积显著小于模型对照组（P＜0.05）。

表2 犬ADMSCs对低氧缺糖模型RSC96细胞迁移的影响

2.4 犬ADMSCs对低氧缺糖模型RSC96细胞增殖、迁移相关基因表达的影响 如图2所示，各处理组NGF 和NT-3的mRNA 表达水平，MSC共培养组显著高于空白培养基组（P＜0.05），而与模型对照组的显著性不差异（P＞0.05）。Nrg-1 的mRNA 表达水平，MSC 共培养组显著高于其余三组（P＜0.05）。

图2 各组间RSC96细胞增殖、迁移相关基因的mRNA表达水平

3 讨论

本试验结果表明，MSC 可促进低氧缺糖RSC96 细胞的增殖，提高细胞的迁移率和细胞增殖（NGF、NT-3）、迁移（Nrg-1）相关基因mRNA的表达量。提示MSC 治疗SCI 可能通过增强SC 活性来促进损伤修复。

为揭示MSC 促进RSC96 细胞增殖及迁移的分子机制，本试验检测了NGF、NT-3、Nrg-1 等基因的表达水平。NGF 是一种神经营养因子，对神经元存活及促进轴突生长具有重要作用［7］。NT-3 基因可促进神经干细胞增殖，促进其他细胞向神经元的分化等。本试验中NT-3基因表达量的增加可能有助于提升髓鞘含量和轴突再生，从而改善动物的运动功能。Nrg-1基因在SCI后，可以通过酪氨酸激酶受体信号传导至OPC，部分OPC转化为功能性SC，从而自发性修复脊柱功能性髓鞘［8］。

MSC是位于中胚层的一种未分化细胞，具有多分化潜能，大量研究表明，MSC对SCI的修复具有积极作用，但其机制目前尚存争议。将MSC移植至受损脊髓组织后，可促进胶质细胞释放神经营养因子和成纤维生长因子等，从而促进神经细胞修复［9］。

综上所述，本次共培养离体试验探究了MSC修复髓鞘损伤的分子机制，初步证明MSC对受损髓鞘的修复主要是通过改善损伤环境，促进施万细胞的增殖和迁移来实现的。