区美怡

(温氏食品集团股份有限公司//农业部动物营养与饲料学重点实验室，广东 云浮 527400)

色氨酸(Trp)，又名α-氨基-β-吲哚丙酸，在动物生长发育中不可或缺，一方面色氨酸可以促进动物肝脏蛋白质的合成，促进动物的生长和代谢；另一方面色氨酸在动物代谢过程中转化的5-羟色胺、喹啉酸、犬尿氨酸、褪黑激素等产物在调节畜禽的采食量、繁殖、神经功能、抗应激和免疫反应上发挥重要作用[1-2]。大量研究表明，适当提高饲粮色氨酸水平，能显著改善畜禽的生长和繁殖性能[3-5]。

酸水解作为氨基酸检测的前处理方法，会破坏样品中的色氨酸，目前普遍采取碱水解单独对色氨酸样品进行前处理。色氨酸的检测方法主要有荧光法、氨基酸分析法、液相色谱法等[6-10]。检测过程中使用碱解剂的种类、浓度和用量、流动相pH值、碱水解时间等因素均会对色氨酸的检测结果产生影响[11-13]。本试验选取常规的植物性和动物性饲料为研究对象，样品经过碱水解处理，采用高效液相色谱法测定，该检测方法操作简单、准确度高。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC H-Class)，配紫外检测器；艾本德离心机(Centrifuge 5804R)；氮吹装置；鼓风干燥箱；梅特勒-托利多万分之一分析天平(±0.000 1 g)；梅特勒-托利多十万分之一分析天平(±0.000 01 g)；梅特勒-托利多pH计；塑料螺纹安瓿瓶；容量瓶。

甲醇：色谱纯；冰乙酸：优级纯；试验用水：超纯水；乙酸钠缓冲液(pH=4.5)：称量0.70 g无水乙酸钠，加入1 000 ml水，搅拌溶解，用冰乙酸调节缓冲液至pH=4.5；氢氧化锂溶液(4 mol/L)：称量33.6 g氢氧化锂，加入200 ml水，搅拌溶解。

试验饲料样品均收集于温氏集团下属饲料厂，样品用中药粉碎机粉碎过0.25 mm孔筛，密封保存待测。

1.2 试验方法

1.2.1标准储备液的配制

准确称取约0.025 g(精确到0.000 01 g)色氨酸对照品(Sigma 纯度≥99.5%)，置于塑料螺纹安瓿瓶中，加入3 ml氢氧化锂溶液，氮吹2 min后立即拧紧瓶盖。在110±1℃烘箱中反应20 h，取出冷却至室温，用乙酸钠缓冲液将碱解液转移并定容至50 ml棕色容量瓶中，摇匀静置，即得色氨酸标准储备液，在2～8℃保存，有效期7 d。

1.2.2样品前处理

饲料样品用分样器缩减取样，经高速中药粉碎机粉碎过0.25 mm孔筛，混匀后密封保存，备用。称取粉碎后的饲料样品0.1～0.2 g(精确到0.000 1 g)，置于安瓿瓶中，加入3 ml氢氧化锂溶液，氮吹2 min后立即拧紧瓶盖。在110±1℃烘箱中水解20 h，取出冷却至室温。用乙酸钠缓冲液将碱解液转移并定容至50 ml棕色容量瓶中，摇匀静置，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，供上机检测。

1.2.3色谱分析条件

色谱柱:Waters XBridge®BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；紫外波长：280 nm；流动相：乙酸钠缓冲溶液(pH=4.5)+甲醇=95+5；柱温：25℃；流速：0.2 ml/min，进样量：10 μl。

2 结果与分析

2.1 方法检测限及线性范围

准确吸取色氨酸标准储备液10 ml，用乙酸钠缓冲液(pH=4.5)稀释成系列浓度色氨酸标准溶液。试验按照1.2.3的色谱条件进行分析，得到以色氨酸浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标的标准工作曲线，如图1所示。色氨酸的线性回归方程为：A=16 360c+88 376，线性范围为6.977～558.195 mg/L，R2=0.999 6，分别以3倍噪音水平和10倍噪音水平计算检出限和定量限。经过计算，检出限为17.32 ng/kg，定量限为191.22 ng/kg。样品空白添加定量限浓度，计算得出定量限回收率为100.07%，说明该方法准确可靠。

图1 色氨酸标准工作曲线

2.2 方法的精密度和准确度

取豆粕平行样5份，按照1.2的试验方法同时处理样品，5份豆粕样品中色氨酸的平均含量为5.04 mg/g，相对标准偏差RSD为0.69%，此检测方法重复性良好，检测结果如表1所示。选取2种饲料原料，加入3种不同浓度的标准储备液，按照1.2的试验方法，测定色氨酸的加标回收率，计算得出加标回收率为90.15%～105.39%，表明该方法准确、可靠，检测结果如表2所示。

表1 重复性测定结果

表2 加标回收率测定结果

2.3 样品的测定

将色氨酸标准溶液和饲料原料按1.2试验方法进行分析，图2、图3分别为色氨酸标准品及样品色谱图，液相色谱图显示，色氨酸在本试验色谱条件下的出峰时间大约在9.4 min，色谱峰窄而尖，分离效果良好。

图2 色氨酸标准品色谱图

图3 豆粕样品色谱图

采用1.2试验方法与国标方法[10]测定植物性原料和动物性原料样品中的色氨酸含量，结果显示两个方法的结果相对稳定一致，表明本试验方法准确可靠，方法的比对结果见表3。

分别收集常规的高蛋白饲料和低蛋白饲料样品数种，按1.2前处理方法及液相色谱条件测定样品中色氨酸的含量，采用凯氏定氮法[14]同步测定对应样品的粗蛋白质含量。色氨酸与粗蛋白质测定结果见表4和表5。

表4 部分低蛋白原料中色氨酸和粗蛋白质含量

表5 部分高蛋白原料中色氨酸和粗蛋白质的含量

3 结论

本试验采用反向高效液相色谱法测定饲料原料中色氨酸的含量。色氨酸的质量浓度范围在6.977～558.195 mg/L内线性关系良好(R2= 0.999 6)，该实验方法简单可靠，相对标准偏差和加标回收率分别为0.69%和90.15%～105.39%，表明此方法精密度和准确度符合检测要求。收集不同种类的植物性和动物性饲料原料，同步进行粗蛋白质和色氨酸的检测分析，结果显示，高蛋白原料色氨酸的含量普遍高于低蛋白原料样品。