文俊萍，罗达龙

(梧州市食品药品检验所，广西 梧州 543002)

沙丁胺醇、莱克多巴胺及克伦特罗(俗称瘦肉精)，是能够抑制动物脂肪生成，促进瘦肉生产的药物。瘦肉精对人体的危害极大，如长期食用有瘦肉精残留的肉，会有很严重的毒副作用[1-4]。近年来，不少非法商家为了降低饲养成本，提高利润，将瘦肉精添加到喂养猪的饲料中，从而残留在肉内，这将危害广大人民群众的身体健康，如2017年央视“315”晚会曝光江苏某企业非法添加瘦肉精以及2021年央视“315”晚会报道河南省某县养殖户在饲料中非法添加瘦肉精事件，瘦肉精相关事件屡禁不止，因此，检测动物性食品中瘦肉精残留具有重要意义。

有关瘦肉精的检测方法[5]主要有液相色谱-串联质谱法[6-10]、气相色谱质谱法[11]、胶体金免疫层析法、液相芯片技术[12]。目前，液相色谱-串联质谱法技术(GB/T 22147—2008)检测饲料中瘦肉精残留量，样品目标物用磷酸甲醇溶液多次提取，经过滤后离心，水浴氮吹近干，上清液用固相萃取柱净化后测定，实验过程繁琐，耗时长，且容易造成回收率低。因此，有必要开发一种简单、快速的方法用于测定猪饲料中瘦肉精残留量。在线固相萃取技术是近年全新发展的全自动样品前处理技术，现已被成功用于饮用水和生物检测、以及食品中药物残留的高通量检测方法构建，本实验研究就是利用在线固相萃取液相色谱-串联质谱技术[13]建立猪饲料中瘦肉精的分析方法，为猪饲料中非法添加瘦肉精的快速检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

YP6002电子天平(d=0.01 g)，常州市衡正电子仪器有限公司；XA205DU电子分析天平(d=0.01 mg)，梅特勒-托利多；LC-1290/QQQ-6470三重四极杆液相质谱联用仪，Agilent technology。

沙丁胺醇、莱克多巴胺及克伦特罗(纯度均大于95%)，来源于Dr.Ehrenstorfer GmbH。

超纯水(电阻率18.2MΩ.cm，Millipore纯水机制备)，甲酸(色谱纯)，美国Fisher公司；乙腈(色谱纯)，美国OMIN公司。

1.2 标准储备溶液配制

精密称取上述3种标准物质，用乙腈配制成1 mg/ml的储备液，备用。

1.3 混合标准中间液的配制

分别量取上述3种标准储备溶液适量，用超纯水稀释定容，配制成浓度为1 μg/ml的混合标准中间液，备用。

1.4 色谱条件

1.4.1液相部分

在线SPE：富集柱(TurboFlow Cyclone P 0.5 mmid×50 mm)在线萃取泵为安捷伦 1260四元泵，流动相A为水，B为乙腈。分析色谱柱：ACE Ecelx C18150 mm×2.1 mm 2.6 μm，分析泵：安捷伦1290二元泵，流动相A为0.1%甲酸水，B为乙腈。柱温：40℃，进样量：10 μl，六通阀切换，在线SPE上样以及洗脱梯度程序见表1，SPE流路图见图1。

图1 SPE流路图

表1 SPE上样以及洗脱梯度、六通阀切换程序

1.4.2质谱条件

3种目标化合物的质谱检测条件见表2。

表2 3种目标化合物的质谱检测条件

离子源(AJS ESI+)，多反应监测模式(MRM)，干燥气温度：200℃，干燥气流速：15 L/min，雾化器压力：25 psi，毛细管电压：3 500 V，鞘气温度：350℃，鞘气流速：12 L/min。

1.5 供试品溶液制备

称取试样2.0 g(精确至0.01 g)至50 ml具塞离心管中，加入15 ml稀释剂，超声提取15 min，冷却至室温，用稀释剂定容至20 ml，转速4 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待分析(稀释剂：0.1%甲酸水∶乙腈=1∶9)。

1.6 空白基质样品溶液制备

准确称取不含沙丁胺醇、莱克多巴胺以及克伦特罗成分的样品4.0 g(精确至0.01 g)，按上述1.5制备，上清液待用，定容体积为40 ml。

2 结果与讨论

2.1 SPE柱的选择

在各优化条件下，分别使用3根柱子对对照溶液(50 ng/ml)中瘦肉精3个目标物进行测定，考察其对目标物的保留效果。色谱柱1：CAPCELL PAK MF C8 2.00 mmid×50 mm 5 μm(以下简称 资生堂C8)、色谱柱2：Turbolflow Cyclone P 0.5 mmid×50 mm(以下简称 Cyclone P)、色谱柱3：Turbolflow Cyclone 0.5 mmid×50 mm(以下简称 Cyclone)。从峰型和响应值来看，Cyclone P最优，其次是资生堂C8，Cyclone柱对沙丁胺醇近乎毫无保留，因此综合以上因素，最终选择Cyclone P柱子作为瘦肉精SPE柱。

2.2 基质效应的影响考察

两位实验人员分别用超纯水和空白基质提取液(见上述1.6)配制标准曲线，线性浓度范围均为0.5～50 ng/ml，通过比较两位实验人员配制的标准曲线各浓度响应值发现，无论是高浓度50 ng/ml，还是低浓度0.5 ng/ml，本实验中均不存在基质效应影响。

2.3 提取溶剂的优化

本研究分别用0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈和1.0%甲酸-乙腈3种溶液对样品进行提取。称取2.0 g样品，加标量为100 μg/kg，每种提取溶剂做3个平行样品，按1.5所述进行处理，上机测定，分别考察平均回收率。通过比较，发现使用0.1%甲酸-乙腈溶液的3个平行样品实验回收率高于其他两种溶液，同时比较其峰形，最终决定选择0.1%甲酸-乙腈作为样品提取液。

2.4 提取溶剂有机相比例的选择

确定提取液甲酸水的浓度后，为筛选出相对好的提取液并且提高样品回收率，我们通过改变0.1%甲酸水与乙腈的比例，分别是0.1%甲酸-乙腈9∶1、0.1%甲酸-乙腈5∶5、0.1%甲酸-乙腈1∶9，3种比例提取溶剂来观察其回收率，确定样品提取溶液有机相比例为0.1%甲酸-乙腈1∶9。

2.5 SPE柱色谱条件的优化

2.5.1涡流流速的选择

基于Cyclone P 最佳涡流速度为0.5～4 ml/min，为选取SPE柱在冲洗阶段适宜的涡流流速，将基质排阻最大化。我们分别比较了流速为 0.5、1、2、3 ml/min，以对照溶液(50 ng/ml)的响应值作为评价，结果发现响应值最高为1 ml/min，次之是2 ml/min和3 ml/min，最低响应值为0.5 ml/min。因此，为保证尽可能去杂、且不影响目标物的截留，选用1 ml/min作为SPE柱涡流流速。

2.5.2冲洗有机相的优化

为了提高目标物的响应，检测限可以做到更低，通过改变SPE柱冲洗流动相比例来观察其目标物响应值变化，考察流动相为水-乙腈，比例分别为97∶3、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40，由于乙腈比例大于10时，沙丁胺醇基本无保留，所以最终选择水-乙腈比例为97∶3和90∶10来比较，根据两者对3种目标的响应值来看，SPE柱冲洗流动相比例水-乙腈90∶10的响应值比水乙腈97∶3高出1倍多，因此，最终确定选择其流动相为水-乙腈90∶10。

2.6 六通阀切换时间的优化

为确保样品杂质的冲洗测定以及目标物质富集在SPE柱更完全，称取2.0 g样品，加标量在100 μg/kg，分别考察0.3、0.5、1、1.5、2 min 5个阀切换时间，结果发现，1 min切换阀能让目标物富集在柱子上更多，同时能将大分子杂质冲洗更完全(见图2)。

图2 3种目标物的TIC图

2.7 SPE柱冲洗后的物质残留考察

在SPE柱采集了溶剂空白、样品空白、回收样品后，分别对其进行全扫描，冲洗时间设置为3 min。结果发现虽然在进行了样品空白以及回收样品后在m/z 400～500范围存在干扰，但对3种目标物不存在影响，无基质效应，该方法保证了色谱柱内杂质冲洗干净，保护色谱柱与质谱，且对目标物的回收不造成残留影响。

2.8 标准工作曲线和检出限

吸取1.3 混合标准中间液，用水稀释得到0.5、1、5、10、20、50 ng/ml系列浓度的加标样品溶液，以定量离子峰面积对目标物浓度进行线性回归，建立工作曲线。实验表明该方法相关系数R2均大于0.999，检出限按3倍信噪比确定，定量限按10倍信噪比确定，结果如表3所示。

表3 3种目标物的线性回归方程及检出限、定量限

2.9 方法重复性及回收率

在空白饲料中添加5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/kg标准物质进行回收率试验，采用本研究方法与国标GB/T 22147—2008 进行比较，测得回收率和重复性RSD如表4所示。

表4 3种目标物回收率以及重复性(n=6)

由表4可见，本研究方法中饲料瘦肉精在5.0～500.0 μg/kg加标水平，回收率在85%～100%，重复性均小于5%(n=6)，与国标GB/T 22147—2008高级别加标浓度回收率接近，且低浓度加标回收率以及重复性优于国标方法，可能是本研究方法减少了萃取液吹干，过固相萃取净化柱等过程，减少了目标化合物的损失，提高了准确度以及方法重复性。

3 结论

本研究采用On-line SPE-LC-MS/MS技术相结合，通过优化提取溶剂，在线SPE色谱柱条件的优化，建立了猪饲料中瘦肉精的检测方法，该方法能够自动完成样品的在线净化富集，回收率、灵敏度高，适用于猪饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺以及克伦特罗的确证和定量分析，为相关物质的检测提供了有效便捷的技术手段。