马治华，牛丕莲，许惺博，张自萍，周学章，白明生,*

（1.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021；2.哥廷根大学医学中心，德国 哥廷根 37075）

心血管疾病是非传染性疾病中首要威胁人类健康的疾病，对个人和社会造成的负担日益加重，有效防治心血管疾病是一个亟待解决的问题。心肌纤维化是各种心血管疾病发展至后期的共同病理特征，其主要特征是心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）的分化和细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）聚积。研究表明，转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）在纤维化和心肌重构中起着至关重要的作用。TGF-β1介导ECM的产生过程，可诱导CFs分化并促进胶原蛋白合成。因此有效抑制心肌纤维化可延缓心血管疾病后续的发生发展，有利于心血管患者的预后改善，为治疗心血管疾病提供新方法。

近年来大量研究表明，中药具有多途径、多靶点的特点，对心肌纤维化的预防治疗有独特优势，许多中药复方、单味药及其提取物对其均有显著的防治作用。丹参酮IIA可通过TGF-β1/Smad信号通路逆转心肌纤维化；黄连素能抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖以及胶原蛋白合成；四逆汤是一种中药复方，可干预肾素-血管紧张素系统，从而抑制心肌纤维化。

宁夏枸杞是我国传统的药食兼用名贵中药材。枸杞果实中的活性成分有很多，包括枸杞多糖、黄酮、类胡萝卜素、酚酸、甜菜碱、维生素等。研究发现，枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分，枸杞多糖具有降血糖、降血压、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物学功能。然而，枸杞多糖对心肌纤维化影响的研究鲜有报道，本研究利用TGF-β1体外刺激小鼠CFs，建立心肌纤维化细胞模型，探究宁夏枸杞多糖对心肌纤维化的干预作用，为枸杞多糖在心血管类疾病的临床治疗中提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

清洁级C57BL/6新生小鼠，1～3 日龄，购于宁夏医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK（宁）2020-0001）。

枸杞多糖（纯度≥96%） 宁夏沃福百瑞公司。

DMEM/F12培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；TGF-β1 美国Peprotech公司；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（鼠来源）、一抗Vimentin（兔来源） 赛信通（上海）生物试剂有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗北京中杉金桥生物技术有限公司；TritonX-100 生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A.Total RNA Kit I 美国Omega公司；HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR、ChamQTM SYBRqPCR Master Mix试剂盒美国Vazyme公司；胶原蛋白I（collagen I，Col I）、胶原蛋白III（collagen III，Col III）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒北京丽科生物有限公司。

1.2 仪器与设备

MDF-382E（N）超低温冰箱 上海申力科技有限公司；Trans-Blot SD Cell酶标仪、TC20细胞自动计数仪美国Bio-Rad公司；E5311化学发光检测仪 美国GE公司；W211电热恒温水浴锅 北京长源实验设备厂；Power pac HV电泳仪 北京凯元信瑞仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 C57BL/6小鼠CFs原代分离培养

参考刘梦昕等的方法分离培养原代CFs。用乙醚将C57BL/6新生小鼠麻醉后，在无菌条件下，用无菌剪刀和镊子取心尖部位，快速置于含双抗的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.2～7.6）洗3 遍。剔除结缔组织，将心脏剪碎，加入适量胰酶，在37 ℃培养箱中，分次消化，每次5 min，共消化8～10 次。取上清液，并加入等量含体积分数10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12培养基，混匀。过滤混合液，1 000 r/min离心5 min，收集沉淀于培养瓶中，在37 ℃、5% CO条件下培养90 min左右后，将未贴壁的细胞悬液吸出，此时已贴壁的细胞即为CFs，加入DMEM/F12培养基，放入培养瓶继续培养。24 h后更换含10%胎牛血清DMEM/F12培养液，观察CFs的生长情况。

1.3.2 CFs鉴定

采用免疫组化染色检测纤维细胞标志蛋白Vimentin进行CFs鉴定。在无菌的12 孔板中爬片，待细胞贴片30 min左右，补加完全培养液，放于37 ℃、5% CO培养箱中培养12 h。取出，PBS漂洗，质量分数4%多聚甲醛溶液固定20 min后用PBS再次漂洗，体积分数0.5% Triton X-100处理15 min，PBS漂洗，体积分数3% HO处理15 min，PBS漂洗。室温封闭60 min，取出甩干，一抗4 ℃过夜孵育，PBS洗3 次，二抗孵育60 min，PBS清洗，辣根过氧化物酶DAB显色1～10 min，蒸馏水洗，苏木素复染，自来水洗返蓝。体积分数75%、85%、95%乙醇溶液和无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明2 次，中性树胶封片。免疫组化染色为棕黄色，结果为阳性，即为CFs。

1.3.3 细胞分组处理

取培养的CFs，每孔5×10个接种到6 孔板，待细胞贴壁后，实验分为3 组：对照组（完全培养基）、模型组（质量浓度10 ng/mL TGF-β1）、枸杞多糖组（质量浓度10 ng/mL TGF-β1+质量浓度100 ng/mL宁夏枸杞多糖）。继续培养48 h，进行后续实验。

1.3.4 CFs形态及增殖情况观察

CFs细胞分组处理培养4 d后，置于倒置显微镜下观察其形态和数目，并进行拍照记录。

1.3.5 免疫荧光法检测α-SMA表达

待细胞生长至90%左右，以每孔1×10个细胞接种于6 孔板中，分组培养48 h后，质量分数4%多聚甲醛溶液固定10 min，取出玻片、固定，然后用100 μL 0.5% TritonX-100通透15 min，体积分数5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室温封闭60 min，弃旧液，采用α-SMA一抗（（一抗）∶（抗体稀释液）＝1∶500）37 ℃孵育2 h，荧光二抗（（二抗）∶（抗体稀释液）＝1∶500）避光孵育1 h，PBS清洗，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液，倒置荧光显微镜下观察拍照，观察绿色荧光强度。

1.3.6 胶原蛋白I和胶原蛋白III表达水平检测

CFs分组培养48 h后，收集上清液，3 000 r/min离心20 min，收集上清液。按试剂盒说明书要求采用ELISA法检测Col I、Col III表达量。

1.3.7 Western blot测定TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达及磷酸化水平

采用细胞裂解液进行总蛋白提取并用BCA法对蛋白浓度定量，调整所有蛋白质量浓度为3 µg/µL，沸水煮10 min至变性。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将其转移至聚偏氟乙烯膜。用5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，之后分别放于一抗actin、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4（抗体稀释比例为（一抗）∶（抗体稀释液）＝1∶1 500），于4 ℃冰箱过夜孵育过夜，用1×TBST洗6 次（5 min/次），加入相应二抗（抗兔或抗小鼠，（二抗）∶（抗体稀释液）＝1∶10 000）在室温孵育1 h，1×TBST洗6 次（5 min/次）。用发光液A、B等体积混合，用ECL化学发光液于化学发光检测仪中显影，最后用Image J软件对蛋白条带相对灰度值进行分析。

1.3.8 纤维化调节转录因子、和的mRNA表达水平测定

收集各组细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录为cDNA，分别将cDNA、、和及基因引物加至实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）Mix反应体系中，进行qRT-PCR检测。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列参考Song Shuai和戚晓琳等方法，序列如下：：F：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，R：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’；引物序列：F：5’-GGGCTCTGAAGATGCACAT，R：5’-TGGCTTCTCACCAGTGTGGG-3’；引物序列：F：5’-CGCCTCCAAGAAGCCCAA-3’，R：5’-CTGGGTAAAGGAGAGTGGAGTGG-3’；引物序列：F：5’-TGATAGAAGTCTGAACACTCGTTTG-3’，R：5’-GGCTGATTGGCAAGACCTCT-3’；引物序列：F：5’-CCTCAGGGTATTGCTGGACAAC-3’，R：5’-CAGAAGGACCTTGTTTGCCAGG-3’。

1.4 数据处理与统计

采用GraphPad Prism5软件用单因素方差分析对数据进行统计学分析并作图，以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 小鼠CFs鉴定结果

波形蛋白Vimentin为纤维细胞标志蛋白，为鉴定分离所得细胞是否为小鼠CFs，采用免疫组化检测Vimentin。如图1所示，分离所得细胞的免疫组化染色为棕黄色，结果为阳性，符合CFs特征，表明分离所得细胞为小鼠CFs，可用于后续实验。

图1 小鼠原代CFs免疫组化鉴定结果Fig. 1 Results of immunohistochemical identification of mouse primary CFs

2.2 枸杞多糖对TGF-β1诱导CFs形态的影响

如图2所示，TGF-β1诱导后，CFs由梭形、不规则多边形变得细长、狭长，枸杞多糖干预后，细胞形态有所恢复，表明枸杞多糖可使TGF-β1诱导的CFs形态变化有所改变。

图2 形态学观察枸杞多糖对TGF-β1诱导CFs的影响Fig. 2 Microscopic observation of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on TGF-β1-induced CFs

2.3 枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs中α-SMA表达的影响

如图3所示，与对照组比较，TGF-β1诱导后，细胞中α-SMA绿色荧光表达明显增强，而枸杞多糖组相较于模型组，α-SMA绿色荧光表达明显减弱。Western blot检测结果与免疫荧光检测结果一致。如图4所示，与对照组比较，TGF-β1诱导后，细胞中α-SMA表达水平高度显著上调（＜0.001），枸杞多糖干预后，α-SMA蛋白表达水平较模型组高度显著下调（＜0.001）。结果表明在蛋白水平，枸杞多糖对TGF-β1诱导的α-SMA表达有抑制作用。

图3 免疫荧光检测枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs中α-SMA表达的影响（400×）Fig. 3 Immunofluorescence detection of the effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β1 (400 ×)

图4 枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs α-SMA表达的影响Fig. 4 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of α-SMA in CFs treated with TGF-β1

2.4 枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs中Col I、Col III蛋白表达的影响

如图5显示，与对照组相比，TGF-β1诱导后，细胞培养液上清中Col I、Col III蛋白质量浓度高度显著增加（＜0.001），枸杞多糖干预后，Col I、Col III蛋白质量浓度均较模型组高度显著减少（＜0.001），表明枸杞多糖可抑制TGF-β1诱导的Col I和Col III蛋白表达增加。

图5 枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs Col I、Col III蛋白表达的影响Fig. 5 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of Col I and Col III in CFs treated with TGF-β1

2.5 枸杞多糖对TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达及磷酸化的影响

如图6所示，与对照组比较，模型组中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高度显著上调（＜0.001），枸杞多糖组相较模型组，相关蛋白表达均呈高度显著下调（＜0.001）。上述结果表明，TGF-β1成功激活TGF-β1/Smads信号通路，枸杞多糖可通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的激活进而改善心肌纤维化。

图6 枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达及磷酸化的影响Fig. 6 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the expression of TGF-β1/Smads signaling pathway-related proteins in CFs treated with TGF-β1

2.6 枸杞多糖对纤维化调节转录因子Snail 1、Snail 2、Twist和S100A4 mRNA表达的影响

如图7所示，与对照组比较，模型组中/、和的mRNA相对表达量高度显著增高（＜0.001）；与模型组比较，枸杞多糖组的/、和的mRNA相对表达量高度显著下降（＜0.001）。表明枸杞多糖可改善心肌纤维化，与下调纤维化转录调节因子/、和表达有关。

图7 枸杞多糖对TGF-β1诱导的CFs中Twist、S100A4、Snail 1/2 mRNA表达的影响Fig. 7 Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the mRNA expression of Twist, S100A4, Snail 1/2 in CFs treated with TGF-β1

3 讨 论

心脏组织受损时，机体启动修复调节机制——心室重塑。心室重塑过程中形成的瘢痕可替代死亡的心肌细胞，从而起到修复受损心脏的作用，但当心脏持续发生心室重塑就会造成心肌纤维化。心肌纤维化发生时，CFs被活化，活化的CFs过度分泌ECM，ECM主要包括胶原蛋白和α-SMA等。研究表明，心肌纤维化是一个很复杂的病理过程，与许多因素相关。TGF-β1作为重要的促心肌纤维化生物因子之一，可以活化CFs。

宁夏枸杞的干燥成熟果实为药材枸杞子，其味甘、性平，归肝、肾经，有滋肝补肾、益精明目之功效，为茄科枸杞属的一种多分枝小灌木。《中华人民共和国药典》记载，宁夏枸杞成熟果实具有滋补肝肾、益精明目的功效，可用于治疗虚劳精亏、眩晕耳鸣、阳萎遗精、内热消渴、目昏不明等病症。枸杞子中具有多种活性成分，如枸杞多糖、黄酮类化合物、生物碱、氨基酸等。研究表明，枸杞子中最具有提取利用价值的是枸杞多糖。本实验中，TGF-β1刺激CFs后，细胞形态显著变化，细胞数目增多且α-SMA的荧光表达显著增强，Col I、Col III和α-SMA蛋白的表达上调；但加入宁夏枸杞多糖处理细胞后，对上述实验现象起到抑制作用，表明宁夏枸杞多糖可抑制TGF-β1诱导的CFs活化。TGF-β1也可诱导特异性转录因子如、和的表达，进而促进纤维化的发生。研究表明，转录因子、和在纤维化发生中起重要作用。本实验结果显示，用TGF-β1刺激后，、和的mRNA表达增加；给予宁夏枸杞多糖处理细胞后，、和的mRNA表达呈下降趋势。这表明宁夏枸杞多糖可有效抑制纤维化转录因子、和的mRNA表达。

TGF-β1是TGF-β1/Smads信号通路中关键因子。TGF-β1与其受体特异性结合，进而激活下游的Smads蛋白家族，发挥生物学效应，调节细胞内信号传导。Smads蛋白家族与TGF-β1相互协调作用促使心肌纤维化。为进一步探究枸杞多糖如何改善心肌纤维化的发生，对TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达水平进行检测，发现TGF-β1可成功激活TGF-β1/Smads信号通路，使Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表达增多，枸杞多糖干预后，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad4蛋白表达水平出现下调，表明枸杞多糖可能通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的激活，进而减缓心肌纤维化的发生，改善心肌纤维化程度。

综上所述，宁夏枸杞多糖可有效抑制TGF-β1刺激的CFs活化，降低纤维化转录因子、、的mRNA表达，从而促使心肌纤维化Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3和Smad4蛋白表达下调。本实验结果表明枸杞多糖可通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的激活，发挥改善心肌纤维化的作用。