★ 黄鑫 熊辉湧 徐睿琛 盛建洋 鲍杰伟 刘翔 陈虞文 曹奇圣 夏自成 王力

（1.江西中医药大学研究生院 南昌 330004；2.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种与膝关节疼痛和膝关节功能丧失相关的慢性退行性疾病，相关流行病学调查表明，在中国60岁以上人群中，KOA的发病率可达19.4%［1］，且女性患病率大于男性［2-3］；同时随着人口老龄化和肥胖症比例增加，KOA的患病率将持续增加，因为KOA直接对患者的行走功能产生影响，从而引起患者及其家庭生活质量降低和经济负担增重［4］。目前,临床上不断探索KOA的治疗方式，西医治疗KOA常用的非手术治疗方案为外用和口服非甾体类抗炎药，2019年OARSI指南［5］将外用非甾体类消炎药和口服非甾体类消炎药分别为1A级强推荐和1B级弱推荐。但同时指南中指出口服非甾体类消炎药会增加心血管和胃肠道疾病的风险。近年研究表明KOA病程进展和膝关节软骨细胞自噬两者之间有着紧密的联系，软骨细胞自噬水平的降低可导致软骨退变的加剧，自噬成为了治疗KOA的靶点热门方向。传统中医药在临床上治疗该病具有毒副作用小和疗效可靠的特点，前期相关文献［6-9］研究可知，补肾活血类中药内服与丁苏桂热敷剂单独治疗KOA有很好的临床疗效，但补肾活血汤内服联合丁苏桂热敷剂综合中医疗法对兔KOA的软骨组织病理学变化、自噬相关蛋白表达的影响无相关报道。故本研究通过观察补肾活血汤联合丁苏桂热敷剂对兔KOA模型的软骨组织自噬相关蛋白beclin 1、LC3表达的影响，探究补肾活血汤内服联合丁苏桂热敷剂疗法对KOA相关自噬机制，为其治疗KOA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

普通级6月龄新西兰实验兔36只，雌雄各半，体重1.8～2.4 kg，购于长沙天勤生物技术有限公司,许可证号：SCXK（湘）2019-0015。实验动物环境：江西中医药大学动物实验大楼，许可证号：SYXK（赣）2017-004。

1.2 试药和仪器

中药（由江西中医药大学附属医院中药房提供）、双氯芬酸二乙胺乳胶剂（中美天津史克制药有限公司，批号：H20181225）、青霉素（华北制药，批号：（2015）030202659）、乌拉坦（合肥巴斯夫生物科技有限公司；批号：201711072）。兔自噬微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）ELISA试剂盒、兔自噬效应蛋白-1（beclin-1）ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；LC3抗体（proteintech公司）；beclin-1抗体（BIOSS公司）；GAPDH抗体（abcam公司）；羊抗兔HRP标记二抗（碧云天公司）。电泳仪（BIO-RAD公司，型号：mini protean 3 cell）；电转仪（HOEFER，型号：TE77XP）；酶标仪（芬兰雷勃酶标仪，型号：MK3）。

2 方法

2.1 分组及造模方法

将36只新西兰实验兔按随机数字表法分成6组，分别为空白组、模型组、阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤内服组、联合组，每组6只，雌雄各半。除空白组外，其余5组均参照改良Hulth法建立兔KOA动物模型，20%乌拉坦耳缘静脉麻醉，取兔右后肢膝关节内侧入路，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带，术后予青霉素肌注7 d，每天每只20万U，每日2次，强迫运动4周，每日30 min，通过制作光镜观察标本，检测造模是否成功。

2.2 干预方案

5组造模成功后，阳性药对照组右膝关节均匀涂双氯芬酸二乙胺乳胶剂，每日2次；丁苏桂热敷剂组右膝关节外敷丁苏桂热敷剂，药物组成：苏木10 g，艾叶10 g，白芥子10 g，麻黄5 g，大血藤10 g，公丁香5 g，肿节风10 g，千年健10 g，制川乌5 g，肉桂5 g，细辛3 g，络石藤5 g，防己5 g，全蝎3 g。用法：药物混合均匀碾成粉末状，加热30 min，布包外敷，每次30 min，每日2次。补肾活血汤内服组口服补肾活血汤，药物组成：熟地10 g，独活10 g，秦艽10 g，赤芍10 g，当归10 g，川芎6 g，杜仲15 g，川牛膝15 g，补骨脂10 g，骨碎补10 g，狗脊10 g，续断10 g，炙甘草6 g。用法：中药先水浸30 min，再文火煎1 h后滤出药液，然后加入水进行二煎0.5 h后滤出药液，最后将两次煎出的药液混合后加热成浓缩药液；经Meeh—Rubner氏公式计算给药量，每只每日给药量6.17 g/kg，水煎浓缩5 mL灌胃，每日2次；联合组行丁苏桂热敷剂联合补肾活血汤内服干预，以上药物干预时间共6周，6周后耳缘静脉空气栓塞处死6组实验兔，取右膝关节软骨组织。

2.3 观察指标

2.3.1 病理观察 对右膝关节软骨组织行脱水浸蜡及包埋，切片、展片、烤片后行HE 染色，以Mankin's评分进行评估。

2.3.2 Elisa试剂盒检测 选用Elisa试剂盒检测膝软骨组织中相关自噬蛋白beclin1、LC3-Ⅱ浓度。将软骨组织标本匀浆、离心后收集上清液，依次经稀释、加样、温育、稀释配液、洗涤、加酶、再温育、再洗涤、加显色剂、终止反应后测定OD值。

2.3.3 Western Blot法检测 选用Western Blot法检测膝软骨组织中相关自噬蛋白beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达。将软骨组织标本匀浆、离心后收集上清液，依次经蛋白定量、制备PAGE胶、上样及电泳、转膜、检测膜上蛋白、膜封闭和孵育抗体、显色后读取灰度值。

2.4 统计学方法

各项数据统计分析前先行方差齐性与正态性检验，计量资料用均数±标准差（）表示，单因素方差分析用于多组间比较，差异具有统计学意义以P＜0.05或P＜0.01表示，统计数据选用软件SPSS 25.0进行统计分析，所有实验数据均取重复3次以上实验结果的均值。

3 结果

3.1 各组兔膝关节软骨组织光镜下观察结果比较

空白组：软骨细胞形态正常，细胞核形态未见异常，整齐有序排列，均匀分布，无簇集软骨细胞。模型组：软骨细胞可见大量变形凋亡细胞，排列混乱，不规则分布，可见多处细胞簇集。阳性药对照组：软骨细胞排列散乱，分布杂乱，可见一定数量细胞簇集。丁苏桂热敷剂组：软骨细胞排列分布不均匀，可见少许细胞簇集。补肾活血汤组：软骨细胞相对正常，排列分布稍有不均，可见少量细胞簇集，但比前3组数量减少。联合组：软骨细胞大致正常，排列分布略不均，未见细胞簇集细胞。见图1。

图1 各组兔膝关节软骨组织光镜下观察结果（HE染色×200）

3.2 各组实验兔膝关节软骨组织病理Mankin's评分比较

与空白组比较，模型组Mankin's 评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组Mankin’s评分均显著降低（P＜0.01）；与阳性药对照组比较，丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组均明显降低Mankin's 评分（P＜0.01）；联合组与阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组相比较，Mankin’s 评分显著降低（P＜0.01）。见表 1。

表1 各组兔膝关节软骨组织病理Mankin's评分比较（，n=6） 分

表1 各组兔膝关节软骨组织病理Mankin's评分比较（，n=6） 分

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与阳性药对照组比较，☆P＜0.01；与联合组比较，▲P＜0.01。

组别 Mankin's评分空白组 0.67±0.52模型组 10.33±1.37*阳性药对照组 6.83±0.75△▲丁苏桂热敷剂组 5.00±0.63△☆▲补肾活血汤组 4.50±1.05△☆▲联合组 3.33±1.03△☆

3.3 各组兔膝关节软骨组织中LC3-Ⅱ、beclin1浓度比较

与空白组比较，模型组LC3-Ⅱ、beclin 1浓度显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组LC3-Ⅱ、beclin 1浓度均显著升高（P＜0.01）；与阳性药对照组比较，丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组LC3-Ⅱ、beclin 1浓度均明显升高（P＜0.01）；联合组与阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组相比较，LC3-Ⅱ、beclin 1浓度显著降低（P＜0.01）。见表 2。

表2 各组兔膝关节软骨组织中LC3-Ⅱ、beclin1浓度含量比较（，n=6）

表2 各组兔膝关节软骨组织中LC3-Ⅱ、beclin1浓度含量比较（，n=6）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与阳性药对照组比较，☆P＜0.01；与联合组比较，▲P＜0.01。

组别 LC3- Ⅱ /（pg·mL-1） beclin1 /（ng·mL-1）空白组 199.03±7.79 26.90±0.68模型组 64.73±7.51* 12.86±0.52*阳性药对照组 92.53±5.44△▲ 16.83±0.46△▲丁苏桂热敷剂组 113.15±5.33△☆▲ 18.45±0.33△☆▲补肾活血汤组 125.96±9.69△☆▲ 21.07±0.80△☆▲联合组 152.07±9.60△☆ 24.21±0.54△☆

3.4 各组兔膝关节软骨组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相对表达量比较

与空白组比较，模型组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相对表达量显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相对表达量均显著升高（P＜0.01）；与阳性药对照组比较，丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；联合组与阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组相比较，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组兔膝关节软骨组织中beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白免疫印迹结果

表3 各组兔膝关节软骨组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相对表达量比较（，n=6）

表3 各组兔膝关节软骨组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白相对表达量比较（，n=6）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与阳性药对照组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与联合组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ beclin 1/GAPDH空白组 1.63±0.02 1.07±0.05模型组 0.91±0.03* 0.59±0.05*阳性药对照组 0.99±0.01△▲▲ 0.75±0.04△▲▲丁苏桂热敷剂组 1.02±0.00△☆▲▲ 0.83±0.03△☆☆▲▲补肾活血汤组 1.10±0.02△☆☆▲▲ 0.87±0.01△☆☆▲联合组 1.19±0.01△☆☆ 0.97±0.05△☆☆

4 讨论

中医学上将KOA归于“膝痹”范畴，病因多为外邪内虚所致，KOA初发多因外感风寒湿邪或跌打外伤所致，寒邪阻滞经脉气血运行；百病之长为风邪，具有轻扬开泄的特性；湿邪具有重着的特性，使关节黏滞疼痛；跌打外伤所致瘀血，阻滞气血运行，初期阶段若治疗不当致余邪残留，气血与余邪相互搏结，导致病情迁延难愈。内虚为久病未愈，致肝肾损伤或年老体衰，肝肾亏虚。肾主骨藏精，为髓之海，肾虚则髓海失养、骨弱，肝主筋藏血，肝肾亏虚则筋病骨痹。故本实验组提出了KOA“肝肾亏虚，血瘀夹湿”的基本病机。

针对KOA病情反复发作致使关节畸形者，单一的治疗方法常难获效。此时，除应用化瘀祛湿法祛除病邪外，尚应重视补益肝肾，预防反复发作。本项目据此以补肾化瘀祛湿立法，形成内外合用、多途径给药、防治并重的中医综合方案。补肾活血汤由熟地、独活、秦艽、赤芍、当归、川芎、杜仲、川牛膝、补骨脂、骨碎补、狗脊、续断、炙甘草组成。方中以熟地、杜仲、川牛膝、补骨脂、骨碎补、狗脊、续断，补肝肾，强筋骨；赤芍、当归、川芎活血化瘀，独活、秦艽祛风除湿，甘草调和诸药。全方共奏补益肝肾，化瘀祛湿之功。丁苏桂热敷剂则重在祛邪，选用本院名方丁苏桂热敷剂（苏木、艾叶、白芥子、麻黄、大血藤、公丁香、肿节风、千年健、制川乌、肉桂、细辛、络石藤、防己、全蝎），有化瘀祛湿、活血止痛之功，该方在临床运用20余年，疗效确切。丁苏桂热敷剂可直达病所，作用时间长。综上所述，该综合疗法（内服联合外敷多途径治疗），由于各种疗法的协同作用增强了治疗效果，有助于明显提高临床疗效，减少KOA反复发作。

KOA发病机制复杂，软骨细胞自噬是KOA发病和病程进展的重要环节，软骨基质的持续降解和软骨细胞总量的不断降低是KOA主要的病理学特点［10-12］，软骨内唯一的细胞即为软骨细胞，软骨细胞的功能状况直接决定着软骨“健康”情况［13］。自噬是细胞经溶酶体自身吞噬、消化再循环细胞组分的一种细胞自我代谢平衡的过程，对调控细胞活性具有重要作用。Paloma L D F等［14］的研究发现软骨细胞自噬功能降低可引起线粒体功能障碍，进一步出现能量代谢障碍和氧化应激导致软骨细胞损伤。自噬水平的提高能促进软骨细胞功能进而延缓KOA病程的进展［15］。

自噬相关基因LC3与beclin 1在自噬过程中分别充当着执行者和调控者的角色［16-17］。LC3存在形式可分为两种，一种为细胞质中的LC3-Ⅰ（水溶形式），另一种为形成自噬体过程中由LC3-Ⅰ经泛素化系统脂化而来结合在自噬体膜上的LC3-Ⅱ（脂溶形式），LC3-Ⅱ的数量和自噬体形成程度有关；随着自噬水平的提高，LC3-Ⅰ表达降低，但LC3-Ⅱ表达提高，因此，LC3-Ⅱ是一种自噬标记物，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的数值高低与自噬水平的强弱呈正相关关系［18-19］。Beclin 1也是一种参与了自噬体形成的自噬标志物［20］，自噬水平的升降与beclin 1表达的强弱同样呈正相关关系。故可通过将LC3与beclin 1来作为衡量KOA自噬水平的参考指标［21］。

本次实验，经过药物干预后，阳性药对照组、丁苏桂热敷剂组、补肾活血汤组和联合组ELISA检测beclin1、LC3-Ⅱ浓度含量和WB检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、beclin 1/GAPDH蛋白表达水平均有提高，且联合组提高水平优于阳性药对照组、丁苏桂热敷剂、补肾活血汤组。说明联合组能够增强软骨细胞自噬，使软骨细胞能够祛除多余氧化自由基和功能障碍（受损）的细胞结构，改善软骨细胞应对机械压力等各类外界环境的变化适应力，调控膝关节部位的新陈代谢稳态来防治KOA。