张雪梅

（伊犁师范大学，新疆伊宁 835000）

熏马肉和熏马肠是新疆伊犁哈萨克民族过冬必备的食物，同时因为其口感好、风味好受到了新疆人民的喜爱。熏马肠通常是由哈萨克人冬宰的马肉制作而成。取马肋骨附带的瘦肉及肥肉切块后加适量咸盐至充分吸收，塞入洗净的马小肠中，烟熏后悬挂晾干，用木柴火把肉熏干。熏马肠是新疆伊犁哈萨克族的传统美食，营养价值很高，风味独特，广受新疆各族人民欢迎，近年来更是借助交通与网络的发展打开了更大的市场[1-2]。

我国研究学者发现，发酵肉制品中的菌株主要包含乳酸菌、葡萄球菌和微球菌，发酵过程中能够分解肉制品的脂肪和蛋白质，增加肉制品特有的香味[3]。它们在促进风味形成、颜色改善和稳定性、亚硝酸盐降解、硝酸盐还原和产品安全方面发挥着独特的作用[4]。通过筛选出良好的微生物发酵剂可运用于发酵肉制品生产中，能够稳定发酵肉制品的产品质量。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验材料

购自新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州的熏马肠。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、琼脂、乳糖、蛋白胨、D-甘露醇、氯化钠、酚红、HCl溶液和NaOH溶液。

1.1.3 主要仪器

GSP-9080MBE隔水式恒温培养箱，上海博源实业有限公司；ZQLY-180N振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；G型玻璃仪器气流烘干器，郑州长城科工贸有限公司；722S可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；SX-500立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA2104N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；G80D23CN2P微波炉，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；微量移液器。

1.2 实验方法

1.2.1 取样与样品处理

本试验选取伊犁熏马肠作为实验对象，按照食品分析取样方法进行取样，用实验室透明真空自封袋封装好，以无菌的方式取样25 g，加入225 mL无菌生理盐水中，使用食品均质器拍打30 min，此时为稀释度10-1的样品液，充分搅拌后静置；依次进行10倍梯度稀释获得10-2、10-3、10-4和10-5稀释液备用。

1.2.2 分离目标优势菌及培养

固体高盐甘露醇琼脂（Manitol Salt Agar，MSA）选择培养基的配方：牛肉浸膏1.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠75.0 g，D-甘露醇10.0 g，酚红0.025 g，琼脂13 g，蒸馏水1 000 mL，pH值调制为7.2～7.6。

将提前准备好的10-3、10-4、10-5稀释液分别涂布在倒好的MSA选择培养基上，37 ℃条件下培养48 h。挑取表面为白色、光滑、圆形的菌落，重复划线3～4次得到纯菌落。

1.2.3 葡萄球菌的初筛

通过MRS培养基选择分离出的目标优势菌，做革兰氏染色，过氧化氢酶检测，选取革兰氏阳性、过氧化氢酶阳性球菌。将细菌于液态培养基中37 ℃培养24 h后，涂布于MSA固态培养基上，将新生霉素药敏纸片粘贴于培养皿上，经37 ℃ 24 h后观察，做新生霉素敏感试验，如形成抑菌圈则表示该菌株为凝固酶阴性葡萄球菌株[5]。

1.3 菌株生物学特性分析

1.3.1 MSA液体培养基配制

MSA液体培养基配方：牛肉浸膏1.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠75.0 g，D-甘露醇10.0 g，酚红0.025 g，琼脂13.0 g。蒸馏水1 000 mL，pH值调制为7.2～7.6。

1.3.2 pH值对菌株生长的影响测定

通过用酸碱溶液调整MSA液体培养基的pH值，分别调节pH值为6.0、7.0、8.0。向液体培养基中接种分离培养的葡萄球菌，放于37 ℃的振荡培养箱培养48 h，测定600 nm处的吸光值，以MSA液体培养基为空白对照。

1.3.3 NaCl浓度对菌株生长的影响测定

用氯化钠将MSA液体培养基的盐浓度分别调节为5.5%、9.5%、11.5%，以盐浓度为7.5%的自然培养作为对照。MSA液体培养基中接种分离培养的葡萄球菌，各留1支做空白试验，放于37 ℃培养箱培养48 h，在波长为600 nm处测量吸光值，以MSA液体培养基为空白对照。

1.3.4 亚硝酸盐浓度对菌株生长的影响测定

用亚硝酸盐药品将MSA液体培养基的亚硝酸浓度浓度分别调节为 50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1，以亚硝酸浓度0 mg·L-1的自然培养作为对照。MSA液体培养基中接种分离纯化的葡萄球菌，放于37 ℃培养箱培养48 h，在波长为600 nm处测量吸光值，以MSA液体培养基为空白对照。

2 结果与分析

2.1 葡萄球菌的分离

将MSA选择培养基中的菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验，筛选革兰氏阳性菌，球形菌，无芽孢，过氧化氢酶阳性菌株。将筛选出的菌株做新生霉素抗性试验，将筛选出的菌株培养24 h后涂布于MSA固体培养皿，将新生霉素药敏试纸置于培养皿表面，37 ℃培养24 h，观察发现菌株周围形成抑菌圈，抑菌圈＞16 mm，表明该菌株对新生霉素敏感，从而判定该菌株为葡萄球菌。

2.2 pH值对菌株生长的影响

通过实验发现不同pH值下熏马肠中的葡萄球菌生长趋势不甚相同。从实验中可分析出该葡萄球菌株具有一定的耐酸性，将MSA液体培养基放于37 ℃的恒温振荡培养箱中培养48 h，发现在pH为6的MSA液体培养基酸性环境中，通过测试600 nm处的吸光值为1.4，菌株生长情况显著高于MSA液体培养基为中性及碱性环境，即pH值为6时葡萄球菌仍能正常生长，该菌株具有一定的耐酸性（图1）。

图1 不同pH值条件下葡萄球菌生长情况

2.3 NaCl对菌株生长的影响

通过实验发现NaCl的浓度影响熏马肠内葡萄球菌生长情况（图2），图中可看出葡萄球菌的生长随NaCl浓度的增加而逐渐受到抑制，说明浓度为5.50%时有利于葡萄球菌的生长。食盐在发酵肉制品中能抑制细菌的滋生，因此发酵剂需具备耐盐性。

图2 不同盐浓度条件下葡萄球菌生长情况

2.4 亚硝酸盐对菌株生长的影响

在肉制品的制作过中添加亚硝酸盐可抑制肉毒梭菌的生长和发育，改善产品的颜色，形成腌肉特有的味道。能否耐受一定量的亚硝酸盐是选择发酵剂菌种的决定性因素，因为这是一个重要的先决条件。由图3可看到葡萄球菌的生长有耐亚硝酸盐的特性，亚硝酸盐浓度为150 mg·L-1时葡萄球菌生长情况良好。说明对于葡萄球菌具有一定程度的耐亚硝酸特性，因为熏制肉制品中一般都添加一定量的亚硝酸盐，目的是为了更好地保持发酵肉制品的色泽，说明该菌株具有一定的耐亚硝酸盐特性。

图3 不同亚硝酸盐浓度下葡萄球菌生长情况

3 结论

本研究从购自伊犁州本地的熏马肠中利用微生物选择培养分离方法分离出优势菌葡萄球菌。菌株生物学特性分析研究结果显示，葡萄球菌有一定的耐酸性；随着NaCl浓度的增加，葡萄球菌的生长逐渐受到抑制，NaCl浓度为5.50%的情况下菌株生长旺盛；发酵菌株具有耐亚硝酸盐特性是发酵剂的基本要求，实验结果表明分离得到的葡萄球菌具有耐亚硝酸盐特性。本实验结果表示，熏马肠中优势菌种葡萄球菌符合优良微生物发酵剂的生长特性要求，为进一步研究熏马肠中的发酵菌株奠定了理论基础。