黄 翠，单 宏*，李莉莉，梁溪桐，兰 静，张瑞英

（1.黑龙江省农业科学研究院农产品质量安全研究所，黑龙江哈尔滨 150086；2.农业部农产品质量监督检验测试中心，黑龙江哈尔滨 150086；3.农业部农产品质量安全风险评估实验室，黑龙江哈尔滨 150086）

随着社会的发展，人们生活水平的提高，人们对健康愈发重视，开始注重荤素搭配、营养均衡，喜食时令蔬菜。生菜作为即食蔬菜的一种，深受北方人们的喜爱，食用量很大[1]。但因其简单清洗即可入口，本身可能存在食源性致病菌也引起了人们的担忧[2]。受近年来食源性致病菌食品安全问题的影响[3]，为保障人们的身体健康，农业农村部指导多地开展了即食果蔬中致病菌风险因子调查评估[4-5]。本文对2019—2021年哈尔滨市3个蔬菜种植基地种植的生菜及生长水土环境中常见细菌进行了调查分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

2019—2021年，分别采集哈尔滨市3个蔬菜基地7—8月份的大棚栽培绿叶生菜、紫叶生菜及水土环境样品，采样过程中佩戴无菌手套并将样本置于无菌袋内，立即送往实验室，当日进行检测，3年样本采集情况如表1所示。

表1 2019—2021年哈尔滨市蔬菜基地生菜及环境水土中样本采集情况

1.1.2 仪器与试剂

（1）仪器。ABI 7500实时荧光定量PCR仪、拍击式均质器等。

（2）试剂。北京聚和美M5 GoldStar TaqMan Mixture聚合酶；北京陆桥生理盐水、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）、缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硫酸铋琼脂（BS）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、7.5%氯化钠肉汤、Baird-Parker琼脂、甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）、50%卵黄液、P-36E多黏菌素B、营养琼脂、0.1%Chelex；所有试剂均在有效期内。

1.1.3 标准菌株

大肠埃希氏菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌ATCC6538、蜡样芽孢杆菌ATCC11778，均购自北京中原公司。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

（1）细菌的检测。生菜及环境样品中大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽孢杆菌检验依次参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）、《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）、《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）和《蜡样芽胞杆菌检验》（GB 4789.14—2014）进行测定。澳大利亚等国对即食食品中微生物限量要求是大肠菌群数量小于104CFU·g-1，为可接受水平[6]；我国卫生行业标准《蜡样芽胞杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》（WS/T 82—1996）对蜡样芽孢杆菌数量的要求为大于105CFU·g-1的食品会引起食物中毒[7]。

（2）DNA提取及PCR反应。挑取营养琼脂平板上的菌落，加20 μL 0.1% Chelex，沸水浴5 min后，12 000 r·min-1离心5 min，取上清以备PCR反应。参照《出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》（SN/T 1870—2016）和《出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法-实时荧光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中引物序列，反应体系及反应程序。

1.2.2 统计方法

用SPSS 16.0软件对两个检出率差异性做χ2检验统计分析，检验水准为0.05。对于样本量小于40的样本做Fisher精确检验。

2 结果与分析

2.1 哈尔滨市道里区蔬菜生产基地生菜和水土环境中细菌检出情况

如表2、表3所示，2019—2021年共采集哈尔滨市3个蔬菜生产基地生菜和环境样品270份。其中，沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均未检出。生菜中大肠菌群检出率为60.00%（120/200），蜡样芽孢杆菌检出率为59.00%（118/200），紫叶生菜蜡样芽孢杆菌检出率高于绿叶生菜（90.24%＞50.94%，χ2=20.812，p＜0.05）。土壤中的大肠菌群与蜡样芽孢杆菌检出率高于生菜中（大肠菌群：94.29%＞60.00%，χ2=15.413，p＜0.05；蜡样芽胞杆菌为100.00%＞59.00%，χ2=22.041，p＜0.05）。

表2 哈尔滨市蔬菜生产基地生菜样本中4种常见细菌检出情况

表3 生菜及环境样本中常见细菌检出率χ2检验统计分析结果

不同年份绿叶生菜中大肠菌群检出率为2020年高于2019年（χ2=28.719，p＜0.05）、2021年（χ2=14.783，p＜0.05），2020年蜡样芽孢杆菌检出率高于2021年（χ2=9.752，p＜0.05）和 2019 年（χ2=25.297，p＜0.05），差异均为显著。紫叶生菜中大肠菌群和蜡样芽孢杆菌检出率随年份不同没有显著差异。

2.2 哈尔滨市道里区蔬菜生产基地生菜和水土环境中大肠菌群和蜡样芽孢杆菌污染浓度情况

生菜及环境样品中大肠菌群检出浓度如表4所示。生菜中大肠菌群检出浓度多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，环境水中多集中在 10 ～ 99 CFU·g-1，土中多集中在100～999 CFU·g-1，均未超过104CFU·g-1。

表4 哈尔滨市道里区蔬菜生产基地生菜中大肠菌群污染浓度情况

生菜及环境样品中蜡样芽孢杆菌检出浓度如表5所示。绿叶生菜蜡样芽孢杆菌检出范围多在100～999 CFU·g-1，紫叶生菜多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，环境水中多集中在 10 ～ 99 CFU·g-1，土中则集中在10 000～99 999 CFU·g-1，均未超过105CFU·g-1。

表5 哈尔滨市道里区蔬菜生产基地生菜及水土环境样品中蜡样芽孢杆菌污染浓度情况

3 讨论

本文对2019—2021年哈尔滨市蔬菜生产基地中生菜及水土环境样品中大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌污染情况进行了调查，大肠菌群作为粪便污染的卫生指标菌，反映了生菜样品的卫生情况。参照澳大利亚等国对即食食品中微生物限量要求，大肠菌群数量小于104CFU·g-1，为可接受范围，当大肠菌群数量大于104CFU·g-1时，为不合格产品[6]。本次对哈尔滨市基地生菜的调查，大肠菌群的检出率为60.00%，检出浓度均未超过不合格浓度。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是两种常见的致病菌，本次调查中均未检出。在以往的研究中鲜有沙门氏菌在生菜中检出的报道，而金黄色葡萄球菌在河南省[4]、浙江省[8]的生菜样品中均有检出的报道。本次金黄色葡萄球菌在生菜和种植环境样本的调查中均未检出，这可能与地域、气候、环境或种植方式不同有关[9]。蜡样芽孢杆菌为条件致病菌，当蜡样芽孢杆菌浓度到达105CFU·g-1时，可能引起食物中毒[7]，此次对哈尔滨市基地生菜的调查，蜡样芽孢杆菌检出率为59.00%，但检出浓度均未超过105CFU·g-1。总体而言，虽然本次调查大肠菌群和蜡样芽孢杆菌检出比率较高，但检出浓度并未超过风险浓度，但考虑到微生物随温度有一定的消长，紫叶生菜蜡样菌定量分析，考虑其即食性，仍存在一定的食品安全隐患。

就不同年份来说，哈尔滨市基地绿叶生菜中大肠菌群检出率2020年高于2019年和2021年，蜡样芽孢杆菌检出率2020年高于2021年和2019年，这可能与不同年份气候条件变化有关[10]。就不同生菜类型讲，紫叶生菜中蜡样芽孢杆菌污染风险较绿叶生菜高，这可能与叶片中色素种类及含量不同或叶片的表面质地不同对致病菌吸附能力不同有关[11]。对于种植环境水的调查，本文采集了刚抽取上来的地下水（哈尔滨蔬菜基地多以抽取地下水灌溉为主）、地表的残水和水缸中残留的雨水，发现大肠菌群与蜡样芽孢杆菌检出的样品多为地表的残水和水缸中残留的雨水，而地下水基本未检出，说明刚抽取上来的地下水相对较好。对于土壤的调查，本文采集了种植土，其大肠菌群与蜡样芽孢杆菌检出率与检出浓度均较高，土壤中大肠菌群可能与农家肥的施用有关，而土壤中含有较多的蜡样芽孢杆菌芽孢[12]，并且土壤中蜡样芽孢杆菌检出率高于生菜，推测生菜中蜡样芽孢杆菌污染可能来自土壤，这一观点与刘一倩等[13]的研究相同。

目前，国内外尚未有初级农产品中卫生指标菌与致病菌限量标准。已经实施的《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[14]中仅规定了即食果蔬制品中致病菌限量，即将实施的《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[15]中有蜡样菌限量规定，虽仅限米制品，也可借鉴参考。广东省2016年颁布了食品安全地方标准《非预包装即食食品微生物限量》（DBS 44/006—2016），标准规定去皮或预切的果蔬或果蔬食品中，沙门氏菌不得检出，大肠埃希氏菌超过102CFU·g-1，金黄色葡萄球菌超过104CFU·g-1，蜡样芽孢杆菌超过105CFU·g-1，为不合格样品[16]。我国农产品中食源性致病菌风险评估工作起步较晚，基础数据不充分，农产品中风险因子不清，来源不明，鉴于近年来国际上由致病菌引发的食品安全事件时有发生[17-18]，而国际间往来频繁，国际贸易持续增长，存在食源性致病菌传入我国的风险，因此建议加大对我国农产品，尤其是即食果蔬中致病菌风险评估的力度，充实数据，保证农产品质量安全，确保我国出口果蔬的产品质量，提升我国农产品在国际市场上的地位[19]。同时，加快推进实施良好农业操作规范、良好生产规范和良好卫生规范在内的管理体系，完善生产、运输和销售产业链管理体系也能有效减少病原微生物的污染和传播[20-21]。