张 绒，陈仲婷，刘贤钊，李慧芳

（无限极（中国）有限公司，广东江门 529100）

许多中草药能够抑制微生物的生长，在不同配比的中草药产品中，抑菌成分和作用程度各不相同，有抑菌成分时可能会导致供试品中的微生物无法检出[1]。为消除抑菌成分的影响，需对不同产品建立适宜的微生物限度检查方法。

本研究针对含有中草药陈皮、茯苓等成分的保健食品样品通过人为加入标准菌株，参考《中华人民共和国药典》（2020年版）四部通则（1105）非无菌产品微生物限度检查[2]，对该样品进行计数方法适用性试验，以建立适宜的微生物限度检查方法，保证检验方法的科学及准确性，从而保证产品质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品含中草药成分陈皮、茯苓片剂（21J05AAB01、21J05ABB01、21J05ACB01）。

1.1.2 试验培养基及试剂

平板计数琼脂（PCA）培养基（广东环凯微生物科技有限公司、北京陆桥技术股份有限公司）；孟加拉红琼脂（广东环凯微生物科技有限公司、北京陆桥技术股份有限公司）；无菌生理盐水（氯化钠，AR，广州化学试剂厂）；中和剂1：含3%吐温+1%卵磷脂+1%硫代硫酸钠的PBS溶液；中和剂2：D/E中和肉汤（广东环凯微生物科技有限公司）；中和剂3：含3%吐温+1%甘氨酸+1%硫代硫酸钠的PBS溶液。

1.1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌ATCC 653、铜绿假单胞菌ATCC 27853、枯草芽孢杆菌ATCC 6633、白色念珠菌ATCC 10231和黑曲霉ATCC 16404，均来源于广东省微生物菌种保藏中心（国家专利菌种保藏平台）。

1.1.4 试验设备及耗材

（1）设备：超净工作台（VS-1300-U）、生物安全柜（BSC-1300-II-B1）、生化培养箱（BF400）、霉菌培养箱（MJ-Ⅱ）、恒温水浴箱（DK-S14）、均质器（Pulisifier）、振荡器（MS 3-basic）、移液器及无菌吸头（Eppendorf）。

（2）耗材：无菌三角瓶、无菌培养皿和无菌试管均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 方法适用性试验

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）[3]和《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）[4]进行试验。

（1）样品制备。25 g样品加入225 mL稀释液（或含中和剂稀释液）中充分溶解，混合均匀。

（2）试验组。将试验菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉制成一定浓度的菌悬液加入供试品中，使每 mL样液中含菌量30～300 CFU。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。

作者要写的关键词是“幸福”,但用了形象化的笔触,比如“心里却急烈地跳动”“挤进他底心”“晕倒”“痴呆”等。并且用他想的曾经“孤零”“单独”“孤独”的他来反衬,进一步凸显此刻的幸福。

（3）样品对照组。取制备好的样液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

（4）菌液对照组。取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代样液，按试验组操作加入试验菌液。

1.2.2 专属性试验

在供试品中接种一定数量的混合试验菌，制成高、中、低3组浓度，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法检验。

1.2.3 重复性试验

在供试品中接种一定数量的混合试验菌，分别由2名不同实验员在不同时间、不同条件下，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法分别进行菌落总数、霉菌和酵母菌总数的检验。

1.2.4 精密度试验

1.2.5 耐用性试验

在供试品中接种一定数量的混合试验菌，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法分别进行菌落总数、霉菌和酵母菌总数的检验，比较2种不同供应商的培养基培养后的试验数据。

2 结果分析

2.1 方法适用性试验结果

通过表1可知，供试品中含有一定的抑菌活性，当使用中和剂1（3%吐温+1%卵磷脂+1%硫代硫酸钠）时，可以有效消除抑菌活性，使金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉有较好的回收PR值（PR值在0.5～2.0），而对枯草芽孢杆菌使用中和剂2（D/E肉汤）、调节pH 6.5～7.5、膜过滤以及使用中和剂3（3%吐温+1%卵磷脂+1%硫代硫酸钠），试验结果的回收PR值均＜0.5，之后的试验项目取消对枯草芽孢杆菌的验证。

表1 计数方法适用性试验结果

2.2 专属性试验结果

通过表2、表3可知，当样品加入低、中、高3个浓度的目标菌株时，菌落总数、霉菌和酵母菌总数的实验回收率均≥70%，符合专属性要求。

表2 菌落总数专属性试验结果

表3霉菌和酵母菌总数专属性试验结果

2.3 重复性试验结果

通过表4、表5可知，参照《中国药典》（2020版）四部（9201），以相对标准偏差评价方法重复性，不同人员菌落总数、霉菌和酵母菌总数的试验结果的RSD值均小于15%，符合重复性要求。

表4 菌落总数重复性试验结果

表5 霉菌和酵母菌总数重复性试验结果

2.4 精密度试验结果

通过表6、表7可知，参照《中国药典》（2020版）四部（9201），以相对标准偏差评价方法的精密度，菌落总数、霉菌和酵母菌总数通过高、中、低3个试验菌浓度，每个浓度进行3次重复试验的计数结果的RSD值均小于35%，回收率均大于70%，符合精密度要求。

表6 菌落总数精密度试验结果

表7 霉菌和酵母菌总数精密度试验结果

2.5 耐用性试验结果

通过表8、表9可知，两个供应商的培养基的菌落总数、霉菌和酵母菌总数的试验结果对数绝对值差均≤0.25，符合耐用性要求。

表8 不同供应商菌落总数培养基的对比结果

表9 不同供应商霉菌和酵母菌总数培养基的比对结果

3 结论

（1）该保健食品样品按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016进行菌落总数、霉菌和酵母计数测定，方法适用性验证结果均符合方法学要求。该样品有一定的抑菌活性，根据试验数据可知，使用3%吐温+1%卵磷脂+1%硫代硫酸钠作为中和剂，可以有效消除抑菌活性，回收率、重复性、专属性、精密度和耐用性等均符合要求。

（2）验证使用的枯草芽孢杆菌经过添加3%吐温+1%卵磷脂+1%硫代硫酸钠作为中和剂、D/E肉汤中和剂、调节pH值为 6.5～7.5、膜过滤等方式其验证效果均不理想，表明该供试品对枯草芽孢杆菌有较强的抗菌活性，同时也表明该中草药保健食品不易被枯草芽孢杆菌污染，所以建议取消对枯草芽孢杆菌的验证试验。

（3）中草药成分复杂，抑菌成分各有不同，任何成分都有可能影响微生物限度检查结果，本研究为微生物限度检查方法适用性试验的研究提供参考和研究思路，进一步保证方法完整和准确[5]。