吕小虎，曹贵东

（1.山西省检验检测中心山西省标准计量技术研究院，山西太原 030027；2.山西瑞象生物药业有限公司，山西太原 030012）

β-葡聚糖是形成细菌、真菌、酵母和谷物（如细胞壁）的天然成分，属于非淀粉型多糖。不同类型的β-葡聚糖其分子骨架、分支水平和分子量有所不同，这些因素影响β-葡聚糖的溶解度，另外其水溶性与β-1，3-糖苷键的含量有关。β-葡聚糖可以刺激人体的免疫系统，能够极大程度地提高人体的自然免疫力，具有抗肿瘤性质，可以帮助机体消除自由基。在很多国家，葡聚糖已经被广泛应用于食品保健、医药、化妆品等行业。

为了更好地在工业中利用β-葡聚糖，需要筛选高效的β-葡聚糖酶。目前，酿酒业和饲料生产中均有这样的应用实例。在啤酒生产中大麦是主要原料，大麦的胚乳和糊粉层细胞壁的主要成分是β-葡聚糖，它在酿酒过程中无法被完全分解，从而导致麦汁粘度大、过滤困难，引起啤酒的浑浊和非生物沉淀增加。采用β-葡聚糖酶可以使麦汁的过滤速度和得率大幅提升，从而优化啤酒品质、减少原料浪费。在饲料工艺中谷物是主要原料，由表1可知，谷物中β-葡聚糖含量较高，它通过其网状结构结合吸收自身质量数倍的水，阻碍肠道蠕动。单胃动物在食用这些饲料后，β-葡聚糖无法完全分解，在胃中形成粘稠状的食糜，加重了胃的负担，从而影响营养成分的消化和吸收。因此，目前在饲料中添加高产β-葡聚糖酶微生物是国内外研究的热点。王丽丽筛选出耐热性高达70℃，酶活力为82.64 U·mL的β-葡聚糖酶菌株；裘纪莹等、王伟等和郭成栓也集中研究了产生β-葡聚糖酶微生物的分离、筛选及选育。本研究从自然界筛选β-葡聚糖酶高产菌株，利用DNS法对其酶活进行测定，并从分子水平对其进行鉴定，为高产β-葡聚糖酶微生物提供丰富的种质资源，为进一步工业化利用提供基础。

表1 常见谷物中β-葡聚糖含量

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品 太原汾河公园丁香树土样。

1.1.2 初筛培养基 β-葡聚糖1 g，刚果红0.4 g，蛋白胨10 g，KHPO1 g，MgSO0.1 g，CaCl0.4 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，121℃灭菌20 min。

1.1.3 发酵产酶培养基 β-葡聚糖1 g，蛋白胨10 g，KHPO1 g，MgSO0.1 g，CaCl0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，121℃灭菌20 min。

1.1.4 营养琼脂培养基 蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，121℃灭菌20 min。

1.1.5 牛肉膏蛋白胨培养基 蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，121℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 土样处理 取太原市汾河公园丁香树下土壤1.0 g，置于250 mL三角瓶中，加入100 mL无菌生理盐水，用玻璃棒搅拌至土壤无结块，放在37℃恒温摇床上150 r·min震荡培养2 h，制备浓度为10g·mL的土壤悬浮液。

1.2.2 产β-葡聚糖酶菌株的分离与筛选 取土壤悬浮液，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，至浓度为10g·mL。分别吸取10、10、10的稀释梯度悬浮液各200 μL，涂布到初筛培养基上，放置于37℃的恒温培养箱中培养2～5 d。

1.2.3 β-葡聚糖酶菌株的纯化保存 在超净台内观察、挑选在初筛培养基上形成明显透明圈的菌落，在营养琼脂培养基上划线，放置于37℃的恒温培养箱中培养2～3 d。然后，将其点接在初筛培养基上，37℃培养48 h。选取透明圈明显的菌落，用甘油保存菌种。

1.2.4 酶活力测定（DNS法） β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解为寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和带有还原性基团的单糖能在沸水浴中产生显色反应，反应后的颜色变化愈明显则表明酶解产生的还原糖越多，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。在540 nm波长下3，5-二硝基水杨酸与还原糖生成的氨基化合物具有最大吸收波，所以可以利用DNS法来测定β-葡聚糖酶的酶活。通过分光比色测定反应液颜色的强度，计算出反应液中β-葡聚糖酶的活力。测定方法如下：

（1）标准葡萄糖溶液配制。准确称取无水葡萄糖100 mg，加80 mL蒸馏水溶解，定容至100 mL，现配现用。

（2）标准曲线绘制。取7支带有刻度的15 mL试管，按表2配制标准溶液，经沸水浴10 min，立即冷却后定容至15 mL。测定各管标准溶液的OD值（540 nm），以葡萄糖质量（mg）为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖拟合曲线，求得=a+b一元线性方程中的a和b值。

表2 葡萄糖标准曲线绘制

（3）酶活力测定。取初筛培养基上有明显透明圈的菌落，经纯化后接入到发酵产酶培养基中，在37℃条件下150 r·min震荡培养48 h。取菌液5 mL于离心管中，于4℃经10 000 r·min离心5 min，取上清液1 mL，用pH值5.0的醋酸缓冲液溶解并稀释10倍。按照表3方法进行酶样品OD值的测定。同时设空白对照。每种酶样品做3组平行。按照以下公式计算酶活力，并在（＜0.05）水平上进行差异显著性分析。

表3 酶活力测定的反应步骤及试剂用量

β-葡聚糖酶酶活定义：在50℃，pH值5.0，每分钟水解β-葡聚糖产生1 μg还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U）。计算酶的活力依据以下公式：

葡聚糖酶的活力=（S×D×1 000）/（1×10）式中，S为光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖含量；D是用醋酸缓冲液稀释酶样的倍数；1 000为mg与ug之间换算系数；10为酶促反应时间。

1.2.5 生长曲线绘制 将筛选到活性最高的菌株，接入到牛肉膏蛋白胨培养基中，在37℃条件下150 r·min震荡培养，分别取0、4、8、12、24、36、48、72 h的菌液于600 nm测吸光度值。

1.2.6 菌株总DNA的提取 采用TIANamp细菌基因组DNA试剂盒提取酶活最高菌株D-1的总DNA，通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量。

1.2.7 16S rRNA扩增（1）通用引物：SF：5'-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3'；SR：5'-AAGGAGGTGATCC AGCCGCA-3'。

（2）PCR反应体系：模版2 μL，引物4 μL，2XTaq PCR Master Mix 25 μL，加ddHO至50 μL。

（3）PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火1 min，72℃退火2 min，35个循环，72℃延伸1 min。

（4）取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并在紫外灯下观察结果。

1.2.8 序列测定和系统发育树构建 经由PCR扩增纯化后得到的16S rDNA，送上海生工生物工程有限公司公司进行测序。将所得序列提交GeneBank数据库比对，并在GeneBank中下载8条相似性较高的细菌16S rDNA序列进行聚类分析，所用软件为Clustal X(windows-xp-2.0)，采用Neighbor-joining方法，通过MEGA6进行系统发育树构建。

1.3 数据处理

试验数据采用平均值±标准差的形式表示，运用SPSS 22.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 丁香树土样中产β-葡聚糖酶菌株的筛选

用β-葡聚糖酶初筛培养基对汾河公园丁香树下采集的土壤进行细菌分离培养，结果如图1所示，有3个菌落明显不同，在菌落周围能够产生透明圈。将3个菌株进行纯化并保存，命名为D-1、D-2和D-3。

图1 初筛培养基菌落生长情况

2.2 酶活力测定

2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 由图2可知，葡萄糖溶液浓度与540 nm吸光度值线性关系良好，相关系数大于0.99。

图2 葡萄糖标准曲线

2.2.2 酶活力测定 将3株明显可以看到透明圈的菌株纯化后，采用DNS方法进行酶活测定。通过与葡萄糖标准曲线比较，笔者发现D-1菌株酶活力高达103.67 U·mL（表4）。差异显著性分析结果显示，D-1的酶活力显著高于D-2和D-3菌株产生的酶活力（＜0.05）。

表4 3株分离菌的酶活力比较

2.3 D-1生长曲线测定

通过酶活测定，笔者筛选到1株具有较高酶活力的菌株D-1，采用测定600 nm菌悬液OD值的方法来研究其生长规律，结果如图3所示，D-1的生长明显符合细菌的一般生长规律。0～8 h，此段曲线较为平缓，处于迟缓期，菌体接入到新环境中有一个短暂的适应过程。此期间细菌的体积在增加，生长代谢非常活跃，为后期的生长繁殖做物质储备。8～24 h，此段曲线斜率大，细菌以稳定的几何级数快速生长。24～36 h，细菌达到了稳定生长期，曲线接近平直，此时培养基中营养物质消耗、毒性产物积累，细菌生长速率下降。36 h后，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多，生长曲线呈下降趋势，生理代谢活动趋于停滞。

图3 D-1菌株生长曲线

2.4 D-1总DNA提取

由图4可见，胶板上荧光条带清晰，说明成功提取出了D-1菌株的总DNA，并且浓度较高。

图4 D-1菌株的总DNA电泳图

2.5 D-1总基因组中16S rRNA扩增

对菌株D-1进行16S rDNA扩增后，经电泳检测，可以看到泳道上有清晰的条带（图5），通过与Marker比较，PCR产物目的条带为1 500 bp左右，与16S rRNA目标产物大小一致。

图5 D-1菌株PCR扩增产物凝胶电泳

2.6 序列比对与系统发育树构建

2.6.1 序列分析 将扩增后产物送上海生工生物工程有限公司进行双向测序，通过DNAMAN拼接可得到如下序列：AACCTGCCCATAAGACTGGGATAA CTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTT TGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCG GCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGA TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAG TCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGC TTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAARSCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC CGGAAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGGTG GTTTCTTAAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCA ACCCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTG AGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAG CGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACT GAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT GCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGYCTCTTTAGTGCT GAAGTTAACGCATTAAGCACTCYGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGYCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAAYGCGAAGAAYCTTTACCAGGTC TTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTT CTYCTTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATG GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTG CCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCG GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA ATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT GCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCG CGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAG TTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCACGAGAGTT

2.6.2系统发育树的构建 将拼接好的序列登录NCBI进行序列比对，结果显示与芽孢杆菌属（sp.）序列相似性高达99%以上。选择了7株不同种的芽孢杆菌和1株大肠杆菌构建系统发育树（图6），发现D-1菌株与蜡样芽孢杆菌（）聚为一个类群，初步确定D-1菌株属于蜡样芽孢杆菌。

图6 D-1菌株的系统发育树

3 结论与讨论

本研究从丁香树下土壤中分离筛选得到3株高产β-葡聚糖酶的菌株，通过DNS法对其酶活进行测定，其中D-1菌株酶活达到103.67 U·mL，该菌株在8～24 h达到生长对数期。通过分子生物学鉴定并构建系统发育树分析发现，D-1与属于同一分支，同源性高达99%以上，初步确定为蜡样芽孢杆菌。

国内对高产β-葡聚糖酶的微生物菌株研究大多集中于黑曲霉（）和里氏木霉，芽孢杆菌也可以分泌此酶，如枯草芽孢杆菌。但高产β-葡聚糖酶的蜡样芽孢杆菌是本实验室首次从土壤中分离得到的菌株。芽孢杆菌抗逆性很强，在工业化生产中具有明显的优势。因此，本研究将继续从培养条件和发酵条件优化入手，使菌株的生长发酵条件达到最优，从而提高其产酶能力，为进一步研究其产酶机理并进行工业化生产奠定基础。