蓝福胜，王晓英，刘晓玲

（1.福建省食品药品质量检验研究院，福建 福州 350001；2.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350001）

氟维司群是一种新型的雌激素受体拮抗剂，以乳腺癌细胞的雌激素受体为靶标，下调其蛋白水平，治疗对象为已接受雌激素受体拮抗治疗或治疗过程中复发的绝经后乳腺癌患者。临床研究表明患者对本品的耐受性良好，可明显降低关节疾病不良反应发生率[1-3]。氟维司群药用原料为白色粉末，在水中几乎不溶，为确保制剂质量有必要对其中的微生物进行控制。

《中华人民共和国药典》（2020年版）非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准规定：需氧菌总数不得大于103cfu/g或cfu/mL；霉菌和酵母菌总数不得大于102cfu/g或cfu/mL[4]。当采用倾注法进行药品中微生物计数时，由于部分药用原料在水中的溶解度低，制成的供试品溶液含有大量的微小颗粒，接种至胰酪大豆胨培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基后，生长的细菌菌落与药物颗粒不易区分，对菌落的鉴定和计数造成困难。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）是一种脂溶性光敏感复合物，溶于水后成无色溶液，但被还原后即呈红色而不溶于水的三苯基甲腙（TPF），TPF较稳定，不易在空气中氧化。细菌在新陈代谢中产生的琥珀酸脱氢酶可使无色的TTC还原成红色的TPF[5]，因此，TTC可作为细菌生长的指示剂。为准确区分菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等，《药品检验标准操作规范》（2019年版）[6]规定：可在培养基中添加一定含量的TTC，用量应以不抑制微生物生长为宜。

本文分别以含不同含量的6种TTC对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌生长的影响及对细菌的指示作用进行试验，确定了药用原料微生物计数时TTC在琼脂培养基中的最适合浓度，并建立了科学、高效的氟维司群原料药微生物计数方法。

1 材料与方法

1.1 材料

⑴ 菌种：金黄色葡萄球菌（StaphyLococcus aureus）[CMCC(B) 26003]（G+代表）、枯草芽孢杆菌（BaciLLus subtilis）[CMCC(B) 63501]（芽孢杆菌代表）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]（G-代表）、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(F) 44102]（肠道菌代表）、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC (F)98001]（酵母菌代表）、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC (F) 98003]（霉菌代表），均购自北京三药科技开发有限公司。

⑵ 培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号：200525）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（批号：210116）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号：210929）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）（批号：190212）均购自北京三药科技开发有限公司。

⑶ 试剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：210409，北京三药科技开发有限公司）；氯化钠（批号：20190802，国药集团）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（批号：918F031，Solarbio；批号：C10164419，Macklin；批号：30187713，国药集团）；聚山梨酯80（批号：220304，西陇科学股份有限公司）。

⑷ 仪器：电子天平（型号：TX2202L）；高压蒸汽灭菌器（型号：HVA-110）；低温培养箱（型号：M IR-2 54-P C）；恒温培养箱（型号：IL812C）；生物安全柜（型号：MSC1.8A2）；振荡水浴槽（型号：SW23）。

⑸ 氟维司群：（药用原料，批号：00004AA003-5，福建基诺厚普生物科技有限公司）。

1.2 方法

⑴ 菌悬液：按照2020年版《中华人民共和国药典》1101菌液制备方法依次制备每1 mL不大于100 cfu和10000 cfu的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉菌孢子悬液。

⑵ 0.1%TTC溶液：精密称定0.1 gTTC至100 mL蒸馏水，溶解，115 ℃高压灭菌20 min，于4 ℃冰箱中避光保存。

⑶ 含不同含量TTC培养基：临用时，在每100 mL温度不超过45 ℃的TSA或SDA添加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL的0.1%TTC溶液，摇匀，分别制成含0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.001%TTC的TSA或SDA。

⑷ TTC适用性试验：参照刘晓玲《2,3,5-三苯基氯化四氮对菌落计数的影响研究》[7]，即取稀释好的菌悬液1 mL接种至90 mm的无菌平皿中，分别注入15～20 mL含不同浓度TTC的琼脂培养基，混匀，凝固，30～35 ℃倒置培养，作为试验组；注入15～20 mL不含TTC的琼脂培养基，混匀，凝固，30～35℃倒置培养，作为对照组。培养48 h后观察菌落颜色并点计菌落数。

⑸ 微生物计数方法适用性试验：按《中华人民共和国药典》2020年版1106计数方法适用性试验要求，取1∶10供试液9.9 mL，分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、白色念珠菌5个试验菌的菌悬液0.1 mL（≤10000 cfu/mL），漩涡振荡使其与供试液充分混匀后，取1 mL置于直径为90 mm的无菌平皿中。需氧菌总数计数注入15～20 mL温度不超过45 ℃的TSA或含0.0005%TTC的TSA，霉菌和酵母菌总数计数注入15～20 mL温度不超过45 ℃的SDA或含0.0005%TTC的SDA，每一培养基各接种2皿。置规定温度倒置培养72 h后，观察平皿上菌落生长情况并点计菌落数。

⑹ 供试液：取氟维司群10 g，加入含0.5%聚山梨酯80的pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，45 ℃水浴10 min，振摇混匀，作为1∶10供试液。

2 结果

2.1 TTC 对6种微生物生长的影响

除白色念珠菌外，其余5个试验菌在含0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%及0.001%TTC的TSA上生长良好且试验组和对照组的菌落计数结果基本一致。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌及大肠埃希菌菌落均呈红色。由表1可知，当TSA中的TTC含量大于0.0007%时，白色念珠菌菌落计数回收率小于0.7且随着TTC含量的升高回收率进一步降低，而在SDA上试验含量TTC对白色念珠菌生长无影响，3个品牌TTC试验结果一致。

表1 TTC对白色念珠菌的影响

2.2 氟维司群微生物计数方法适用性试验

由表2和表3可知，在 TSA上，由于试验组金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌落较小且无色，故与供试品颗粒不易区分而无法准确计数。在含0.0005%TTC的TSA上，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及铜绿假单胞菌均呈红色，与白色供试品颗粒区分明显。5个试验菌回收率均在0.8以上，符合药典要求（0.5～2.0）。

表2 氟维司群需氧菌总数计数方法适用性试验结果（倾注法，n=3）

表3 氟维司群霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验结果（倾注法，n=3）

3 结论

氟维司群原料药需氧菌总数取1∶10供试液1 mL按倾注法计数，由于TSA中含有大量白色、不溶性微小颗粒，细菌菌落易与供试品颗粒混淆，造成无法准确进行菌落计数。而在TSA中加入TTC至终浓度为0.0005%后，可使培养基深层生长的细菌菌落呈红色且不会对试验菌的生长造成影响，便于试验人员对菌落进行准确计数。因此，相比不加TTC而将供试品进一步稀释至1∶100以上进行菌落计数，该方法耗时更少、更科学。

4 讨论

TTC 可作为细菌菌落指示剂，它在药品、食品及化妆品菌落总数计数中均有应用，原则上TTC的含量要求不抑制或延缓微生物的生长且对细菌的指示性显著。目前，在药品微生物计数中，含TTC培养基对白色念珠菌生长是否造成影响，未见相关报道。笔者通过考察0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.001%6种含量TTC对TSA中G+、G-、芽孢杆菌、肠道杆菌、酵母菌及霉菌的影响，结果显示0.0005%～0.001%TTC对G+、G-、芽孢杆菌、肠道杆菌的显色效果良好且无生长抑制作用，这与《药品检验标准操作规范》（2019年版）推荐的使用浓度一致。但当培养基中TTC含量大于0.0007%时，TSA和SDA上白色念珠菌的菌落计数结果具有较大差异，表现为TSA上TTC对白色念珠菌的生长抑制作用明显且随着浓度的增加抑制作用增强，而在SDA上添加相同含量的TTC后不会对白色念珠菌的生长造成影响。由于TSA为中性培养基（pH：7.3±0.2），SDA为酸性培养基（pH：SDA 5.6±0.2）且每1 L的SDA中含有40 g葡萄糖，TSA中无此成分，因此形成上述差异很可能与酸性环境和含有葡萄糖更有利于白色念珠菌的生长繁殖使其快速形成对TTC的耐受力有关。综上，TTC作为细菌指示剂在不同菌落计数培养基中的添加量并不一致，这一点在《化妆品安全技术规范》（2015年版）[8]菌落计数时对于TTC推荐用量为每100 mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1 mL0.5%TTC相吻合，药品微生物检验人员应根据培养基特性选择合适含量的TTC。