王 锴,高银鹤,王 革,徐瑶瑶,刘 盛,赵 烽

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学)、新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台 264005)

新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎,COVID-19)已知症状为发热、乏力、干咳,伴随有咽痛、鼻塞、流涕和腹泻[1],随着病情的进一步加重会逐渐发展为中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病[2]。从新冠肺炎患者的数据分析中发现,肺炎患者的淋巴细胞计数显著降低,众多炎症因子(如IL-6、TNF等)显著增高[3],这些炎症因子可以和自身受体相结合,引起肺纤维化、内皮功能障碍及炎症反应,从而进一步引发多种疾病,如肺水肿、心律失常和凝血障碍等[4-5]。因此,抑制炎症因子对于治疗新冠肺炎有至关重要的意义。

连花清瘟胶囊(国药准字Z20040063)主要由连翘、金银花、麻黄、苦杏仁、板蓝根、甘草等组成,能够清瘟解毒,宣肺泄热,在临床上常运用于流行性感冒的治疗,还能缓解新冠肺炎中包括发烧、鼻塞、流涕、咳嗽等的一些临床症状[6],但其治疗新冠肺炎的作用机制仍未明确。

本研究利用网络药理学方法筛选连花清瘟胶囊治疗新冠肺炎的有效成分及炎症相关的作用靶点,并对与靶点相关的生物过程和作用通路进行富集,通过构建多个化合物-靶点-疾病的网络来探讨连花清瘟胶囊治疗新冠肺炎的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

Chem Office 2016, Swiss Target Prediction database (http://www.swisstarget prediction.ch/), Gene Cards 数据库(https://www.genecards.org/), STRING数据库(https://string-db.org/), PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/),Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/), PDB 数据库(https://www.rcsb.org/), Metascape 数据库(http://metascape.org/), Cytoscape3.7.1和Moe2008.10等。小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7购自中科院上海细胞库,96孔细胞培养板,CO2培养箱,酶标仪,固体NaNO2,Griess试剂,槲皮素,山奈酚和芫花素等。

1.2 方法

1.2.1 活性成分和靶点的筛选 将连花清瘟胶囊中的活性成分板蓝根、大黄、甘草、广藿香、金银花、苦杏仁、连翘、麻黄和鱼腥草输入TCMSP数据库,对得到的化合物结构使用PubChem确证,并保存成SMILES格式;将化学式导入Swiss target prediction数据库中,选择“Homo sapiens”为研究物种获得药物的预测靶点。

1.2.2 疾病预测靶点的获取 GeneCards知识库自动整合来自大约150个网络资源的以基因为中心的数据,包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传、临床和功能信息。以“COVID-19”和“炎症”作为关键词,从数据库中检索出共1042个新冠病毒相关基因的信息;从数据库中检索出466个炎症相关靶点信息,选取其中相关分数大于10分的靶点。

1.2.3 复方-疾病交集基因的获取 应用Venny 2.1平台处理药物靶点和疾病靶点,得到三者的韦恩图,交集靶点作为潜在的靶点。

1.2.4 蛋白相互作用(PPI)网络构建和分析 将连花清瘟胶囊的活性化学成分与新冠病毒相关的潜在靶标输入 STRING 数据库,设置蛋白种类为“Homo sapiens”,最低相互作用阈值为0.4。将得到的蛋白相互作用结果以TSV的格式,导入到Cytoscape 3.7.1 软件,对PPI 蛋白网络进行互作分析。其中,化合物和靶点由节点表示,化合物和靶点之间的相互作用由边表示,节点的大小、颜色的深浅变化代表度(Degree)值的大小,并根据节点的度值筛选出核心靶点。

1.2.5 富集分析 GO(Gene Ontology)是基因本体联盟建立的一个数据库。GO数据库有三类,即细胞成分(CC)、生物过程(BP)和分子功能(MF),分别描述了基因产物所在的细胞环境、所涉及的生物过程和可能的分子功能。基于Metascape数据对核心靶标进行 GO功能富集分析以及 KEGG通路分析。选择物种为人(Homo sapiens),设定阈值p<0.01,点击分析后可以得到相关的通路信息。

1.2.6 分子对接 将筛选出来的10个化学成分的结构式能量最小化,3D优化后,保存成mol格式。选择PPI网络中度值前29位的靶点作为受体,通过MOE软件去除掉多余小分子后,质子化并使其能量最小,然后导入优化好的配体进行分子对接,得到化学成分与靶点相互作用产生的对接分数。对接分数≤-37.68、≤-29.31及≤-20.93 kJ/mol分别代表较强、良好和一定的结合活性。

1.2.7 Griess法检测化合物对炎症介质NO的影响 为了验证网络药理学对连花清瘟胶囊发挥抗炎作用的核心成分的研究,进一步探究了核心成分对炎症介质NO的影响,采用Griess法检测NO2-的浓度,从而间接反映细胞所产生NO的浓度。步骤如下: (1)NaNO2标准曲线的绘制:精密称取NaNO2粉末0.69 g放入洁净干燥的离心管中,加入10 mL培养基,配制成1 mol/L的NaNO2溶液,使用前用培养基分别稀释成5、20、40、60、80、100 μmol/L的标准品溶液,另设置0 μmol/L空白培养基溶液。不同浓度的NaNO2溶液各取100 μL加到96孔板中,再分别加入100 μL Griess试剂。通过酶标仪在波长540 nm下测定其吸光度,并绘制NaNO2标准曲线。(2)将处于对数生长期且生长状态良好的RAW 264.7细胞按照细胞计数方法稀释至1×106个/mL,然后按照每孔200 μL的体积,将细胞液接种于96孔板中。(3)将铺有RAW 264.7细胞的96孔板放入条件为5% CO2,37 ℃的细胞培养箱中培养1 h,待细胞贴壁后加入化合物。(4)将实验分为三组:空白组、化合物组、LPS组,每组设3个平行复孔。空白组只加0.4 μL的 DMSO,给药组加入2 μL的LPS(终浓度1 μg/mL)和0.4 μL不同浓度的山奈酚、槲皮素和芫花素(终浓度分别为6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μmol/L),LPS组加入0.4 μL DMSO和2 μL 的LPS(终浓度1 μg/mL)。之后将96孔板放入条件为5% CO2,37 ℃的细胞培养箱中继续孵育24 h。(5)24 h后,每孔吸取100 μL的细胞上清液加到另一酶标板中,同时100 μL/孔加入预先混合均匀的Griess试剂,摇床上低速振摇10 min,540 nm处测吸光度(A540)。(6)将A540代入标准曲线计算细胞上清液中NO2-的浓度。

2 结 果

2.1 复方化学成分及药物靶点

在TCMSP数据库中,以DL(类药性指数:Drug-likeness)大于或等于0.18和OB(口服生物利用:Oral Bioavailability)大于或等于30%为筛选条件,输出各中药成分的化合物靶点信息(表1)。

表1 连花清瘟胶囊中有效成分具体信息

2.2 潜在靶点预测

对Swiss数据库中得到的预测靶点去重筛选后,共计收集连花清瘟胶囊的活性化学成分预测靶点907个,中药-有效成分-靶点具体信息见表1。通过GeneCards数据库最终得到炎症靶点466个,新型冠状肺炎靶点1042个。将化合物与疾病的靶点输入Venny 2.1 在线做图工具平台后,得到韦恩图(图1),得到连花清瘟胶囊干预新冠肺炎的潜在靶点57个,其中关键靶点涉及IL6、TNF、TLR4、CXCL8和NOS2等。

图1 连花清瘟胶囊,炎症和新冠肺炎的靶点韦恩图

2.3 化合物-靶点网络构建及分析

将化合物、潜在靶点等信息导入Cytoscape软件,使用Cytoscape3.7.1中的 Network Analyze工具建立“化学成分-靶点作用网络”,如图2所示。

图2 活性成分和靶点的作用网络

由图2可见，网络共有155个节点、572条边。圆形代表活性化学成分,方形代表核心靶标,不同药物用不同颜色表示,化合物和靶点的关联由各条边来表示,其中与核心靶点联系最密切的10个化合物按照度值大小排列在表2中,参数的度值越大,表明该化合物相关的节点数越多,其在网络中的重要性就越大。连花清瘟胶囊中含有多味中药,而一种化学成分通常对应着多个交集基因靶点,且一个交集基因与靶点与多个化学成分相联系,这说明连花清瘟胶囊治疗新冠肺炎是通过多成分、多靶点、多通路相互作用而产生作用的,其核心成分共10个,包括山奈酚、槲皮素和芫花素等。

表2 核心中药成分和度值信息

2.4 交集基因PPI网络构建与分析

应用STRING数据库对交集基因进行导入,初步构建蛋白的相互作用网络,见图3。构建的网络图包含57个节点、710条边,靶点的颜色越深代表与该靶点关联的靶点越多,在疾病治疗中起到的作用越大。以“Degree>中位数(23)”筛选出核心靶点 29个(表 3)，推测以上靶点可能是治疗新冠肺炎的重要靶点。

表3 核心靶点和度值信息

图3 蛋白相互作用网络

2.5 富集分析

为了进一步探究连花清瘟胶囊治疗新冠肺炎的作用机制,运用Metascape数据库中的GO生物功能和KEGG通路，分别对核心靶标进行基因本体论功能富集分析和基因组百科全书通路分析。富集结果如图4所示,多种途径相互作用发挥抗炎作用,形成一个复杂的网络。不同的颜色代表不同的路径,颜色深度代表P值的大小。在GO生物功能分析(P<0.01)中涉及到的通路有很多,其中与炎症有关的信号通路分别是脂多糖反应通路、细胞因子调控通路、急性炎症反应通路和外界刺激调控通路等。图片中log10P值越小, 说明核心靶点与该通路联系密切的可能性越大,该通路在治疗新冠病毒的过程中可能发挥较大作用。KEGG通路(P<0.01)中可能在治疗作用中扮演着重要角色的通路有MAPK信号通路和NF-κB信号通路等。通过以上两种富集分析功能可以得知,连花清瘟胶囊治疗新型冠状病毒存在多靶点、多通路的协同作用,可以调节不同的生物通路发挥药效。

图4 富集分析结果

2.6 分子对接

以得到的核心中药成分为分子探针,选择PPI网络的靶点蛋白作为筛选对象,以结合能作为筛选指标,在MOE(Molecular Operating Environment)分子对接软件平台上进行了分子对接研究。从表4的对接结果看出,得到的核心中药成分中的槲皮素,山奈酚以及芫花素,与筛选出的29个核心靶点均有较强作用,其中靶点NOS2和以上三种化合物的结合能最低, 说明连花清瘟胶囊治疗新冠肺炎的主要中药核心成分可能为山奈酚、槲皮素和芫花素,核心靶点可能为NOS2。

表4 受体和配体的结合能

2.7 Griess法检测化合物对炎症介质NO的影响

为了验证连花清瘟胶囊核心成分山奈酚、槲皮素和芫花素与核心靶点NOS2的关系,采用Griess法检测其对炎症介质NO的影响。由图5可见,随着槲皮素、山奈酚和芫花素浓度的升高,LPS诱导RAW 264.7细胞产生的NO逐渐减少,表明这三种核心成分对炎症介质NO均有一定的抑制作用,且呈剂量依赖关系。

图5 槲皮素、山奈酚和芫花素对LPS诱导RAW 264.7细 胞释放NO的抑制作用

3 讨 论

连花清瘟胶囊入血成分具有多成分、多靶点、多通路的特点,能通过调节相关细胞因子及信号通路发挥清除抗原、调节免疫和保护组织器官的作用,从而发挥对新冠肺炎的治疗作用[7]。通过介导MAPK/NF-κB信号通路可以调控体内炎症因子水平从而降低脂多糖引起的肺部炎症反应,对肺损伤进行保护[8-9]。本研究的富集分析结果显示,连花清瘟胶囊核心成分通过多条信号通路参与炎症的治疗作用,如MAPK信号通路和NF-κB信号通路,各通路相互作用构成复杂的交互网络,共同抑制新型冠状病毒肺炎。通过激活NF-κB信号通路,p38磷酸化增强和ERK磷酸化降低后,可以提高NOS2上调和NO产生[10]。本研究分子对接结果显示,连花清瘟胶囊靶点NOS2与核心成分中，山奈酚、槲皮素和芫花素的相互作用最强,推测连花清瘟胶囊中的活性成分可能通过调节相关炎症靶点,抑制炎症的发展,从而发挥治疗新冠肺炎的作用。

山奈酚有较好的抗炎活性[11],可降低小鼠放射性肺损伤的程度,对小鼠放射性肺损伤具有防治作用,其机制可能与山奈酚抑制NF-κB及MAPK通路有关[12]。王旭杰等[13]发现,山奈酚可能通过与 SARS-CoV-2RBD区域残基相结合,阻断病毒S蛋白与ACE2受体间的相互作用。槲皮素对脂多糖(LPS)引起的机体免疫应答和炎症反应具有抑制作用,干预炎症因子的表达,可以达到抗炎、抗病毒等疗效[14-15]。经过200 mg/kg槲皮素治疗的小鼠肺组织炎性病变明显减轻,并且NF-κB通路相关蛋白表达水平下降,提示槲皮素抑制金黄色葡萄球菌肺炎小鼠炎症反应与其抑制NF-κB炎症信号通路有关[16];槲皮素抗分选酶A可对肺炎链球菌生物被膜形成产生抑制作用[17],从而产生治疗肺炎的作用。曾垣烨等[18]的研究揭示了槲皮素在新冠肺炎治疗中的抗炎作用:通过有效调节机体细胞因子的释放,抑制炎症风暴,改善肺功能。徐宇琴等[19]的研究也表明,槲皮素和山奈酚能降低促炎因子 IL-6 、TNF-α 、IL-1β的水平,进而抑制核因子-κB,从而抑制炎症反应,并能够有效缓解肺损伤。芫花素具有抗炎和抗癌等作用[20-22],可以调控NF-κB信号通路干预炎症[23],在肺炎含量测定、鉴定、药理实验研究方面都具有重要意义。本研究中初步抗炎活性实验亦表明,山奈酚、槲皮素和芫花素均能通过抑制NO水平而表现出较好的抗炎活性,这与连花清瘟胶囊干预新冠肺炎炎症机制,从而产生治疗作用的目的相吻合。

4 结 论

连花清瘟胶囊中的山奈酚、槲皮素和芫花素等可能是治疗新冠肺炎的有效成分，这些成分调节细胞因子的表达,通过在多靶点、多通路的作用,进而起到改善炎症、调节免疫和治疗新冠肺炎的效果。通过初步实验阐明了山奈酚、槲皮素和芫花素均能通过抑制炎症介质NO的表达从而表现出较强的抗炎活性,进而达到治疗新冠肺炎的目的,进一步的机制研究仍在进行中。本研究为新冠肺炎的治疗及拓展中药药物的临床应用提供了依据。