孙 倩,刘万卉,纪云霞,王运庆

(1.烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台 264005;2.中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室,烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003)

微/纳塑料(microplastics, MPs/nanoplastics, NPs)作为一类新型颗粒污染物,已引起全世界科学家和民众的广泛关注[1-2]。微/纳塑料不仅大量存在于环境中,也来源于日用塑料制品中。日用塑料制品在生产、储存和应用过程中,受到挤压、摇晃、刺穿、摩擦等机械外力作用,可以形成大量MPs/NPs粒子[3-4]。这些粒子可通过经口暴露、呼吸暴露和皮肤渗透等途径进入人体,对人类健康构成潜在威胁[5-7]。揭示其细胞毒性和生物学效应是亟待解决的重要问题。

MPs摄入量在空气、饮用水和海鲜中占绝大多数,其中室外空气中含MPs大约为5.4 个/m3,一些环境相关浓度下MPs毒性的实验室研究中,通常使用1 mg/L作为MPs的暴露浓度阈值,该数值与多个现场调查中报告的最大浓度为相同数量级[8]。全球159个自来水样本中,81%含有微塑料颗粒,大多数直径小于5 μm,总平均浓度为5.45 个/L[9]。这些浓度数据具有现实的环境意义,尽管目前还没有常规的方法可以检测NPs,但预计它们至少与较大的MPs颗粒一样丰富。根据人类可能暴露的环境培养基的一些研究,估计这些培养基的每日MPs剂量如下：空气吸入每日MPs的暴露量为81个,饮用水摄入每日MPs的暴露量为28个,工业暴露中甚至约高达5～40 mg/m3[10]。虽然生活中真实暴露浓度远低于实验浓度,但考虑到MPs/NPs人体暴露浓度的不确定性、摄入率和组织蓄积等问题,本研究以MTT实验结果为指标,选择响应值较低的浓度进行极性暴露实验,以考察其慢性长期蓄积的生物效应。

聚丙烯(polypropylene,PP)是一类重要的日用塑料材质,广泛用于生产餐饮容器(餐盒、水杯、奶瓶等)和医疗用品(一次性注射器、输液用包材、透析膜等),具有很高的人体暴露风险,但目前尚未有对PP MPs/NPs的毒性进行系统研究的报道。针对上述问题,通过机械破碎和差速离心方法,制备了PP MPs/NPs模型粒子。选择单核巨噬细胞(RAW 264.7)和肝细胞(HL 7702)作为细胞模型,采用粒子荧光标记和活细胞成像技术开展细胞毒性效应研究。

1 材料和方法

1.1 化学品和试剂

PP颗粒购自罗恩试剂公司,直径约3 mm。尼罗红和十二烷基磺酸钠(SDS)购自Sigma公司。HL 7702和RAW 264.7细胞购自上海生命科学研究所细胞库。RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、5%胰蛋白酶购自Gibco。链霉素、青霉素、双苯甲酰亚胺(Hoechst) 33258染色液、5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-碘化四乙基亚胺(JC-1)检测试剂盒、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自碧云天试剂公司。四氢呋喃(THF)和二甲亚砜(DMSO)购自济昌纳米公司。工作中使用超纯水(实验室自制)。

1.2 PP MPs/NPs的制备与表征

采用机械破碎法制备PP MPs/NPs[11-12]。将 40 g PP颗粒置于装有200 mL SDS溶液(0.001%)的烧杯中。利用厨房搅拌机(Panasonic MX-G51,600 W)进行机械破碎。搅拌机的工作方式设置为搅拌1 min,静置7 min,24 h之后,将SDS的质量分数增加到0.003%,并在相同的工作模式下继续工作24 h。静置10 h后,用一次性注射器取出悬浮液。考虑到不同粒径颗粒的沉降速度不同,MPs/NPs分别通过1 000 r/min和14 000 r/min差速离心20 min获得。MPs/NPs沉淀采用0.01% SDS溶液悬浮以保持良好的分散性。为了获得准确的样品浓度,将MPs/NPs溶液分成两等份;一半在真空干燥箱中40 ℃干燥24 h,干燥后的样品用百万分析天平称重;另一半用0.01% SDS溶液稀释至5 mg/mL,置于4 ℃备用以进行后续细胞暴露实验。

在S-4800场发射扫描电子显微镜(SEM,Hitachi,Japan)上采集PP MPs/NPs的SEM图像,并使用Nano Measurer软件随机分析PP MPs/NPs粒子。荧光成像通过Leica SP8共聚焦显微镜(CLSM,Leica,Germany)获得。采用 Zetasizer NanoZS90(Malvern Instruments,UK)测量样品的Zeta电位。

1.3 PP MPs/NPs的荧光标记

PP MPs/NPs溶液(0.5 mg/mL,1 mL)与2 μL尼罗红(5×10-4mol/L,溶于四氢呋喃)混合,振荡孵育2 h。将混合物以14 000 r/min离心30 min并用超纯水洗涤3次。

1.4 细胞培养和细胞摄取

将RAW 264.7和HL 7702细胞置于37 ℃空气/CO2(95∶5)培养箱中,并使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养。在暴露实验中,采用无血清培养基进行细胞培养。RAW 264.7和HL 7702细胞接种24 h,尼罗红标记的PP MPs/NPs(80 μg/mL)与无血清培养基孵育1、3和6 h,采用CLSM成像(λex=405 nm,λem=410～460 nm;λex=594 nm,λem=600～650 nm),并通过Image J 软件定量分析两种细胞中的荧光强度。

1.5 细胞毒性评估

采用MTT方法评估细胞毒性。将RAW 264.7和HL 7702细胞(密度为6×103个/细胞)进行96孔细胞培养板铺板。24 h后弃去培养基,将细胞与200 μL含有不同质量浓度(20、50、80、100、150、200 μg/mL)PP MPs/NPs的无血清培养基在37 ℃培养箱中培养24 h。每孔加入MTT溶液(0.5 mg/mL,100 μL),继续孵育4 h。最后加入150 μL DMSO溶解甲臜,用酶标仪测定吸光度(λ=490 nm)。

1.6 细胞内ROS水平测定

DCFH-DA探针用于检测细胞内活性氧(ROS)水平。用含有PP MPs/NPs(80 μg/mL)的无血清培养基孵育RAW 264.7和HL 7702细胞24 h,收集细胞,预冷的PBS洗涤3遍。DCFH-DA探针染色20 min,采用FCM检测细胞内ROS,并进行定量分析。

1.7 线粒体膜电位测量

JC-1法用于测定线粒体膜电位(MMP)的变化。用含有PP MPs/NPs(80 μg/mL)的无血清培养基孵育RAW 264.7和HL 7702细胞24 h,收集细胞,预冷的PBS洗涤3遍。采用JC-1工作液避光孵育20 min,30 min内进行FCM检测和定量分析。

1.8 细胞凋亡

采用V-FITC/PI染色检测细胞凋亡。用含有PP MPs/NPs(80 μg/mL)的无血清培养基孵育RAW 264.7和HL 7702细胞24 h。收集细胞,预冷的PBS洗涤3遍。用Annexin V-FITC/PI避光孵育15 min,30 min内进行FCM检测和定量分析。

1.9 统计分析

2 结 果

2.1 PP MPs/NPs的制备

如图1(a)、(b)所示,通过对PP进行机械破碎和差速离心分别获得约1 μm的MPs颗粒和约200 nm的NPs颗粒,表示为PP MPs/NPs。PP MPs/NPs在水溶液中的Zeta电位分别为-23.6 mV和-28.2 mV,使其在水溶液中具有良好的分散性。两种颗粒的形态都是不规则的,但粒径分布在很小的范围内(图1(c))。

图1 PP MPs/NPs的SEM图像与粒径分布

2.2 细胞摄取

巨噬细胞在摄取外来颗粒和先天性免疫应答中起重要作用,肝脏是异物颗粒蓄积的主要靶器官,因此本研究选择RAW 264.7巨噬细胞和HL 7702肝细胞作为受试细胞。为了追踪细胞摄取行为,将尼罗红荧光标记的PP粒子和细胞孵育,并采用CLSM成像进行动态监测。CLSM图像显示PP MPs/NPs在1 h内被两种细胞快速摄取(图2(a)、(b)),并分布至细胞质中。随着孵育时间增加(3～6 h),摄取量逐渐增加。细胞内荧光强度的定量分析表明,RAW 264.7细胞中内化MPs/NPs的数量高于HL 7702细胞。此外,RAW 264.7细胞在MPs/NPs之间显示出相似的摄取水平,而6 h时HL 7702细胞对NPs的摄取量明显高于MPs(图2(c)、(d))。

与对照组相比,*P<0.05;与MPs相比,#P<0.05)。

2.3 细胞毒性

通过MTT法评估PP MPs/NPs在两种细胞中的细胞毒性。如图3(a)和(b)所示,PP粒子的细胞毒性效应表现出剂量、大小和细胞类型的依赖性。孵育24 h后,当粒子质量浓度高于50 μg/mL时,细胞毒性随着粒子暴露浓度增加而增加。在相同剂量下,粒子质量浓度达到100 μg/mL时NPs显示出比MPs更高的细胞毒性。在最高测试质量浓度下(200 μg/mL),对于RAW 264.7和HL 7702细胞,NPs的细胞活力降低了40%～50%,而MPs的值仍然保持在下降10%左右。此外,RAW 264.7细胞由于其特异性的细胞功能,其受影响程度低于HL 7702细胞。可能因为RAW 264.7作为一种吞噬细胞,负责杀灭病原菌等外来颗粒,同时分泌抗体中和有害物质,具有较高的毒性耐受性。

与对照组相比，*P<0.05;与MPs相比，#P<0.05;与不同剂量相比，@P < 0.05;与RAW 264.7相比，&P < 0.05。

ROS水平被认为是细胞死亡的主要原因[13]。此外,ROS水平也被证明是纳米材料的重要毒理学指标。采用DCFH-DA荧光探针检测PP MPs/NPs(80 μg/mL)诱导的细胞ROS含量。图3(c)—(e)显示PP NPs对HL7702细胞诱导的ROS水平高于MPs,这可能是由于更快的内化速率和更高的积累量;此外,较小的尺寸和较大的比表面积使NPs易于与细胞内大分子和亚细胞器相互作用,从而导致更多的ROS形成。相反地,RAW264.7的胞内ROS水平不呈粒径依赖性,可能与其对MPs/NPs具有相似的细胞摄取量有关。与RAW 264.7细胞相比,处理后的HL 7702细胞ROS水平显著升高,这一现象与MTT结果一致[14]。

2.4 介导细胞凋亡的线粒体相关通路

细胞内ROS含量增加诱导线粒体膜电位下降,进而导致线粒体损伤[15]。采用JC-1法检测PP MPs/NPs对线粒体功能的影响。FCM结果观察到对照组细胞具有良好的极性,而PP MPs/NPs(80 μg/mL)处理的RAW 264.7和HL 7702细胞的细胞群明显下移(图4(a)、(b)),暗示MPs/NPs能够明显降低两种细胞的线粒体膜电位。MPs/NPs染毒的RAW 264.7细胞红绿荧光比(JC-1聚合体/JC-1单体比)分别降低了47.0%和68.2%,对于HL 7702细胞分别降低了53.1%和75.9%(图4(c))。结果表明MPs/NPs均可降低两种细胞的线粒体膜电位并表现出粒径差异效应,而两种类型的细胞之间的差异不大。

与对照组相比，*P<0.05;与MPs组相比，#P<0.05。

细胞内线粒体膜电位降低导致线粒体功能受损,ATP水平下降,进而引发细胞凋亡[16]。因此,采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡。如图5(a)和(b)所示,PP MPs/NPs均能诱导RAW264.7和HL7702细胞发生凋亡,并表现出细胞类型依赖性。PP MPs/NPs暴露处理24 h后,RAW 264.7细胞凋亡率分别为19.7% 和 36.2%，HL 7702细胞凋亡率分别为23.7% 和 42.0%(图5(c))。PP MPs/NPs 诱导显著的粒径依赖性细胞凋亡,这与线粒体膜电位的变化趋势一致,暗示PP MPs/NPs可能通过线粒体相关途径诱导细胞凋亡。

与对照组相比，*P<0.05;与MPs组相比，#P<0.05;与RAW 264.7相比,&P < 0.05。

3 讨 论

微/纳塑料相关研究已成为热点,其中聚苯乙烯微/纳塑料(PS MPs/NPs)易通过化学聚合反应合成或容易购得商品化的模型粒子,故大多数MPs/NPs毒性研究主要采用PS为研究对象[17]。实验室合成的颗粒通常表现出均一规则的球形形貌、精确可控的粒径和表面化学性质,与现实环境中MPs/NPs存在着很大差异。因此从该模型颗粒获得的实验数据并不能反映真实生物学效应。同时MPs/NPs是复合概念,塑料材质也影响其毒性效应,研究聚焦于PS MPs/NPs不能代表其他聚合物类型。由于PP本身的物化特性,微/纳模型粒子难以通过化学合成制备。已有工作采用固体研磨/筛分方法,仅能获得20 μm到200 μm的大粒径MPs[14,18-19]。普遍认为,NPs较MPs具有更强的生物屏障穿透能力和更高的化学反应性[20],但由于PP NPs模型粒子的缺乏,其真实的毒性效应也尚未得到评估。因此,本研究采用料理机打磨和差速离心方法,制备了PP MPs/NPs模型粒子。

MPs/NPs的粒径明显影响其生物摄取、清除、体内分布和毒性。相比大粒径MPs,小粒径NPs更容易穿过生物屏障,诱导更严重的毒性反应。因此考察了粒径对于细胞摄取效率和细胞毒性的影响。RAW 264.7细胞对PP颗粒的摄取没有表现出粒径相关性,但相比于PP MPs,NPs表现出更高的生物学毒性。对于HL 7702细胞,PP NPs比PP MPs表现出更高的蓄积水平、细胞毒性和ROS含量。与RAW 264.7细胞不同的是,HL 7702细胞作为非吞噬细胞更倾向于摄取纳米级塑料颗粒,这可能是相比于MPs,NPs可采用更多的内吞机制进行胞内摄取[21],如网格蛋白和小窝蛋白相关的内吞机制。在RAW 264.7细胞和HL 7702细胞中,PP NPs 比 PP MPs 表现出更高的线粒体损伤和细胞凋亡,这可能是因为NPs更容易与细胞内大分子和亚细胞器相互作用,导致更高的生物学效应[20]。

细胞类型被认为是影响纳米颗粒与细胞相互作用的重要因素。结果显示PP MPs/NPs与细胞相互作用依赖于细胞类型,RAW 264.7比HL 7702表现出更高的细胞摄取和毒性耐受性。在体内研究中,纳米颗粒在血循环中主要被网状内皮系统的吞噬细胞清除。也有少部分的纳米颗粒避开了网状内皮系统的识别,转运到次级器官并与组织实质细胞相互作用。由于MPs/NPs优先在肝脏中积累,且肝细胞承担了肝脏的大部分代谢功能。因此采用RAW 264.7巨噬细胞和HL 7702肝细胞,考察细胞类型对于MPs/NPs摄取和细胞毒性的影响。PP MPs/NPs在RAW 264.7细胞中的摄取量比HL 7702细胞大约高2倍,而PP MPs/NPs在RAW 264.7细胞中的细胞毒性则低于HL 7702细胞。PP MPs/NPs处理后,RAW 264.7和HL 7702细胞中ROS水平均升高。粒径对RAW 264.7细胞ROS水平影响不大,而NPs导致HL 7702细胞中ROS水平显著升高。

不同细胞的毒性差异可能与细胞功能有关。一方面吞噬细胞能够有效地摄取外来颗粒,及时将其从体内清除；另一方面,吞噬细胞是先天免疫系统最重要的组成细胞,可激活免疫应答,分泌多种细胞因子和特异性抗体,从而表现出较强的耐受性。细胞内ROS的增加进一步诱导线粒体膜电位下降和细胞凋亡。尽管PP MPs/NPs在两类细胞间线粒体膜电位差异不大,但在细胞凋亡方面却表现出明显差异,在HL 7702细胞中表现出更高的凋亡率,提示除了线粒体介导的机制外,还可能存在其他机制介导细胞凋亡。据报道,溶酶体膜通透性增加导致水解酶释放到细胞质中以及内质网可以介导促凋亡和抗凋亡分子的表达,这两种机制均可导致细胞凋亡和细胞死亡[22-23]。后续我们将对这两种作用机制进行考察,来进一步完善PP MPs/NPs致细胞凋亡的机制。

4 结 论

本研究采用机械破碎和差速离心方法制备PP MPs/NPs,考察了其对RAW 264.7和HL 7702细胞的毒性效应和机制。实验结果表明,PP MPs/NPs在细胞内的累积,引发颗粒尺寸和细胞类型相关的毒性效应，毒理机制与诱发氧化应激反应进而引发线粒体损伤和细胞凋亡有关。本研究为PP MPs/NPs的毒理学效应提供了基础信息,提示应对塑料粒子引发的人体健康风险予以关注。