范三鹏，陈巍，齐壮博，魏江春，杨用成，胡高升，贾景明

(沈阳药科大学中药学院，沈阳 110016)

北五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)为木兰科(Magnoliaceae)五味子属(Schisandra)药用植物，药用部位为干燥成熟果实，习称北五味子，始载于《神农本草经》被列为上品中药材[1-2]。五味子果实进入秋季后果实颜色逐渐由青绿色变为红色或暗红色，成熟的五味子果肉质地比较柔软，将果实晒干并除去掺杂的叶片、果梗等杂质，即为五味子药材。五味子种子呈肾形，每颗果实有1～2粒种子，将种子捣碎后有油状物并伴有特殊香气，味辛、微苦。中国药典收载五味子有两种：五味子(S.chinensis(Turcz.)Baill.)(即北五味子)及华中五味子(S.sphenantheraRehd. Et Wils.)(即南五味子)[1]。《本草纲目》有记载指出：“五味子今有南北之分，南产者红北产者黑，入滋补药，必用北者为良”[3]。五味子是一种广泛应用于医药和保健食品的药材，可作为滋补、镇静和促进剂。常用于治疗久嗽虚喘、尿频、久泻、盗汗、心悸、失眠等[4]。现代药理研究表明，木脂素是五味子果实中重要的活性成分，具有保护肝脏、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等丰富的生物活性[5-7]。有机酸也是五味子的主要成分之一，具有止咳化痰的有益药理作用[8]。木脂素的含量受果实成熟度、采收时间、生长环境和产地的影响。原料采收时间的确定多以民间传统经验为依据，缺乏科学依据，导致木脂素含量变化较大[9]。不同的生态环境会导致植物产生和积累各种特殊的代谢产物，导致五味子的品质参差不齐[10]。有研究表明，同一种中草药质量差异的主要原因是药用成分的数量或比例的差异[12]。五味子的药理作用是由其多种化学成分决定的[13-14]，例如，木脂素、多酚、多糖、有机酸等都有药理作用，但作用不同 。对于五味子的质量控制，2020年版《中国药典》将五味子醇甲作为五味子的唯一质量控制标准。目前许多五味子化学分析研究大多集中于某些化合物或某些活性成分[15]。为了进一步研究五味子的质量控制，确定合理的采收期，仅对特定的木脂素进行分析是不够的。尤其在五味子果实成熟期，果实生物量的积累远大于活性成分的积累，现有研究表明[15]五味子在成熟时期，五味子中木脂素的含量都出现明显的降低，因此仅以木脂素的含量来确定五味子的采收期存在一定的片面，应通过多指标，多角度综合分析，确定五味子的采收期。通过测定不同采收期五味子中多种生物活性成分的积累情况，综合评价五味子质量。主要目的是研究不同采收时期对五味子中木脂素、有机酸、总多酚、和花色苷的影响，对药材质量进行评价，进一步确定了最佳采收时期。

1 材料与方法

1.1 样品采集与前处理

研究中使用的五味子采自中国本溪市“关门”山区(124°53′39.2″E 41°14′24.9″N)。采收时间于6月底开始。从五味子开始结果到果实成熟，每隔约15 d采集1次果实。6月29日(HV1)，7月14日(HV2)，8月5日(HV3)，8月23日(HV4)，9月8日(HV5)，9月20日(HV6)。

每个采收期随机采集3组样品，每组随机选取10个果实，人工将其果肉和种子分离，并用冷冻干燥机进行冻干样品，用研钵研成粉末保存于10 mL EP管中。精密称取样品粉末50 mg并加入1.5 mL甲醇，精密称取重量。将上述样品超声(功率250 w，频率40 khz)30 min，冷却至室温，再次精密称重，并加入甲醇溶液以补足失重。常温下离心10 min(12000 r/min)，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤备用。

1.2 生物量测定

果实的横径、纵径采用游标卡尺进行测量。果实的湿重使用万分之一电子天平称重，在冷冻干燥机去除水分，直至样品重量不发生变化时将样品取出，并测定其干重质量，含水率测定采用重量差比法。每个采收期随机选取3株，每株选取10个果实进行测量，求得平均值以及相对标准偏差。

1.3 木脂素含量测定

利用配备二极管阵列检测器(DAD)的Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪对五味子果肉和种子提取物中的四种木脂素进行定量分析。色谱柱为Agilent Poroshell120EC-C18(4.6 mm × 150 mm，4 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱条件为：0 min，51% A；35 min，61% A；37 min，100% A；47 min，100% A；49 min，51% A；59 min，51% A；流速为1 mL/min，进样量：10 μL，检测波长：220 nm，柱温：30 ℃。五味子醇甲的标准曲线方程为：Y=0.0233X-3.4612；五味子酯甲的标准曲线方程为：Y=0.0244X+2.501；五味子甲素的标准曲线方程为：Y=0.0193X+3.2112；五味子乙素的标准曲线方程为：Y=0.0184X+3.018。

1.4 花色苷含量和有机酸含量测定

采用pH示差法测定总花色苷的含量[18]。采用电位滴定法测定五味子中总有机酸的含量[19]。

1.5 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu’s法测定总多酚含量[20]。用甲醇将绿原酸标准品稀释为68.47、102.76、154.07、231.1、346、520、1170 μg/mL。取30μL标准溶液，加入600 μL碳酸钠溶液，摇匀静置5 min。然后加入30 μL Folin-Ciocalteu’s试剂, 摇匀后静置30 min，在750 nm处测定吸光度，回归方程为y=0.0005x + 0.0484,R2= 0.9993。结果表明，绿原酸在68.47～1170 μg/mL范围内有良好的线性关系。

1.6 抗氧化活性测定

对五味子的抗氧化活性进行了测定，并对测定方法做了一些调整[21]。将20 μL的提取液加入到280 μL的DPPH乙醇溶液(终浓度为100 mmol/L)中，混合均匀，避光30 min，在517 nm波长处测量吸光度。甲醇为空白对照。将抗坏血酸母液用甲醇稀释，浓度分别为1、5、25、50、124、166(μg·mL-1)。回归方程为：y = 0.0047x-0.0205，R2=0.9961。结果表明，抗坏血酸(Vc)在1～166 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2 结果与讨论

2.1 果实体积、生物量和含水量动态测定

五味子果实在成熟过程中，果实的体积会逐渐增大，通过对五味子果实横纵径的测定，来确定五味子果实在生长过程中体积的变化。五味子果实发育曲线呈现出“S”型增长趋势(图1)，HV1时期到HV3时期果实生长很缓慢，HV3时期至HV4时期果实进入快速生长期，平均每天横、纵径净增长量均约≥0.1 mm，进入HV4时期以后，果实的体积变化逐渐减小，增长趋于平缓。五味子果肉在整个生长周期含水率无明显变化，并且含水率较大，含水率始终保持在85%～90%之间。种子含水率在HV1至HV3时期呈现出逐渐下降的趋势，在HV3至HV6时期种子含水量趋于稳定(图1)。

图1 五味子果实横径、纵径变化动态与含水量变化动态

其次，测定了五味子生长过程中质量的变化，从图2可以看出，五味子种子的湿重和干重在HV1时期至HV4时期增长变化比较明显，在HV4(0.63±0.044)g时期至HV6(0.64±0.0197)g时期种子的干重增长缓慢，增长趋势平缓，说明在HV1至HV4时期是五味子种子发育生长的主要时期。五味子果肉的湿重变化随着时间的变化逐渐增加(图2)，在HV6时期湿重达到最高值，果肉的干重变化趋势与湿重相同，在HV6(0.65±0.065)g时期达到最高值。

图 2 五味子果肉和种子的干重和鲜重

2.2 有机酸、总酚与花色苷含量

古文记载，五味子“生青熟红紫”，五味子中花色苷的合成也是五味子品质的一个重要考察指标。对6个不同采收期的五味子果实中的花色苷含量进行测定，结果在五味子种子中并没有检测到花色苷，其果肉中含有大量的花色苷。随着五味子果实的成熟，果肉中的花色苷含量呈现出逐渐增加的趋势(图3)，其中在HV1～HV4时期花色苷含量增加缓慢，但HV5期(1.50 ± 0.039)mg/g花色苷含量急剧增加。同时，也对花色苷的积累量进行了统计，其中在HV1～HV4时期花色苷含量增加缓慢，积累较少，在HV4～HV5时期花色苷积累有较大幅度的增加。由此可见，五味子果实中花色苷合成主要集中在HV4～HV5期。

在有机酸的含量测定中(图3)，五味子有机酸分布与花色苷相同，都是主要分布在果肉中，在种子中并没有检测到。五味子果肉中有机酸含量随时间变化逐渐增加，在HV6期(258.8±11.7)mg/g达到最高值，其积累量也是在HV6(167.93±7.21)mg阶段达到最高。

图3 不同采收期五味子果肉中花色苷和有机酸含量

如图4所示，单位质量下，五味子果肉和种子总多酚含量随时间变化呈先上升后下降的趋势，果肉中总多酚含量在HV2(32.69±4.13)mg/g阶段最高，种子中HV3(44.05±0.89)mg/g阶段总多酚含量最高。但是总多酚在五味子果实中的积累量与含量存在一些差异(图4)，在果肉中总多酚的积累量逐渐增加，在HV6期(13.26±1.16)mg达到最大。HV3期(24.76±0.498)mg,HV4期(20.9 ± 1.03)mg种子总多酚含量相对较高。

图4 不同时期种子与果肉总多酚含量和积累量变化趋势图

2.3 木脂素含量

现有研究表明，五味子具有多种药理活性，其中木脂素类成分是其中主要的活性物质；并且在中国药典中，规定以五味子醇甲作为五味子的一个成分指标。在不同采收期的五味子样品中，如图5所示，四种五味子木脂素的含量都出现不同程度的降低，其检测结果于现有文献中报道一致，随着五味子的成熟，其木脂素的含量出现一个下降的趋势。因为五味子在生长过程中，生物的积累量对其含量有一定的影响，单独以含量来确定五味子的采收期是片面的，需要充分考虑生物量的影响，通过木脂素的积累量来规避其生物量的影响。如图6所示，五味子种子中，四种木脂素的积累量都是先升高后下降，然后趋于平稳，积累量的峰值均出现在HV3～4阶段。其中五味子醇甲下降趋势不明显，但是五味子酯甲，五味子甲素和五味子乙素含量下降明显，推测可能合成更下游的产物。

图5 五味子不同收获期果肉与种子中木脂素含量

图6 五味子不同收获期果实中的木脂素的积累量

2.4 抗氧化活性测定

如图7所示，单位质量下，五味子果肉的抗氧化活性随时间变化并没有发生明显变化。在HV2(6.1±0.927)mg/g时期达到最大值。五味子种子的抗氧化活性随时间变化而降低，在HV1期(21.68±0.545)mg/g达到最大。通过积累量来计算五味子果实的抗氧化活性后(如图7)，果肉的抗氧化活性呈现逐渐升高的趋势，并在HV6(10.76±0.12)mg阶段达到最大值。种子的抗氧化活性在HV1～HV3阶段呈现升高趋势，在HV4阶段到HV6阶段逐渐趋于稳定。

3 结论

通过对关门山不同采收期五味子果实进行了多种有效成分的测定，测定内容包括生物量、木脂素含量、有机酸、花色苷、总酚和抗氧化活性六个指标。结果表明，果实的横纵经在HV4(8月23日)之后没有明显的改变，果肉的含水率一直保持在85%～90%之间，种子含水率呈现出下降趋势，在HV3(8月5日)之后含水率保持稳定。花色苷和有机酸的含量随时间变化逐渐增高，在HV5(9月8日)～HV6(9月20日)时期具有较高的含量，是果实颜色发生变化的重要时期。五味子总酚含量在种子中呈现先增高后降低趋势，在果肉中逐渐升高，整体呈现出先增高后趋于稳定。五味子木脂素主要分布于种子当中，五味子果实木脂素的累积含量随时间变化呈现出先增高后降低的趋势，在HV0～HV3时期木脂素合成速率都是正值，含量累积增加。在HV3～HV4时期木脂素合成速率为负值，木脂素含量在逐渐下降，说明8月初是木脂素合成与累积的关键时期。综上所述，五味子虽然在HV3～HV4时期的木脂素含量高，但是果实并未成熟，在HV4～HV5时期，果实色素迅速累积，此时的花色苷、有机酸和总酚均处于较高水平，所以9月中旬采集的五味子品质较高。