杜祎，张金玲，朱凯，朱思荣，史建国，张利群，毕春元

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院生物研究所，济南 250014)

豆豉是用豆类经过多种微生物发酵制得的豆制品调味料，有着悠久的历史，是我国传统调味食品之一，在烹饪时加入豆豉可以增加菜品的香味，因此豆豉受到全国人民的青睐[1-5]。随着生活水平的提高，人们对豆豉的风味和品质提出了更高的要求。谷氨酸是豆豉中一种重要的风味物质，因此，如何检测豆豉中的谷氨酸含量显得尤为重要。

目前，国内外检测谷氨酸含量的方法主要是液相色谱法、毛细管电泳法、离子交换色谱法，这些方法一般需要专业操作人员，且样品需要繁琐复杂的衍生化等预处理，所需试剂大多对人体有害，操作复杂，检测成本高[6-11]。本研究采用固定化谷氨酸氧化酶酶电极技术在恒体积反应池内对豆豉悬浊液进行检测，对线性、稳定性、专一性等方面进行评价和加标回收实验，多方位验证方法的可靠性，为快速检测食品中谷氨酸含量提供了思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆豉：从济南市环山银座购置两种某品牌在售品；谷氨酸氧化酶、牛血清蛋白：美国Sigma公司；戊二醛：国药集团化学试剂有限公司；核微孔膜：美国Nucleopore公司；过氧化氢电极、SBA缓冲剂、“O”形圈：山东省科学院生物研究所；实验中所用试剂均为分析纯，实验中所用水为纯净水。

SBA-40D型谷氨酸生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所；分析天平 德国赛多利斯集团；电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；万能高速粉碎机 永康市蓝晴工贸有限公司；漩涡混合器 上海精科实业有限公司；50 μL微量进样器 上海光正医疗仪器有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；干燥器 四川蜀玻集团有限责任公司。

1.2 测定原理

将谷氨酸氧化酶固定化在聚碳酸酯膜上，以SBA缓冲剂为贴合剂与过氧化氢电极自组装成谷氨酸酶电极。在反应池内，谷氨酸与谷氨酸氧化酶接触后发生氧化还原反应，产生过氧化氢，见公式(1)，过氧化氢在酶电极表面发生电子得失，产生电流，该电流强度与谷氨酸含量成比例，见公式(2)，通过检测电流强度来实现谷氨酸含量的检测。

H2O2，

(1)

(2)

1.3 试剂及酶电极器件准备

1.3.1 100 mg/dL谷氨酸标准液的配制

取谷氨酸钠盐适量，放入30 g称量瓶内，置于电热恒温鼓风干燥箱中，104 ℃处理4 h，取出称量瓶，盖上盖子，放入干燥器中冷却至室温。用分析天平准确称取1.000 g谷氨酸于250 mL烧杯内，加入纯净水溶解，转移至1 L容量瓶中，定容。

1.3.2 谷氨酸氧化酶膜的制备

将核微孔膜制作成直径为0.6 cm的小圆片，正面朝上粘贴在“O”形圈上，然后将牛血清蛋白、2.5%戊二醛、谷氨酸氧化酶的混合液涂抹于核微孔膜的背面，放入电热恒温鼓风干燥箱中，于35 ℃干燥30 min，取出后放入冰箱上层，4 ℃冷藏。

1.3.3 谷氨酸酶电极的自组装

在过氧化氢表面滴1滴SBA缓冲剂，将制备好的谷氨酸氧化酶膜背面浸入SBA缓冲剂中，压紧，挤出气泡，通过白色螺纹固定套将谷氨酸酶电极固定在SBA谷氨酸生物传感器反应池内。

1.3.4 样品测定

取适量豆豉在搅拌机中打碎，并在振荡器上振荡3 min，取1 g样品放入10 mL烧瓶中，加入纯净水溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容。

在SBA-40D谷氨酸反应池内注入缓冲剂，装入谷氨酸酶电极，接通电源，当仪器提示定标时，用50 μL微量进样器注入25 μL配制好的谷氨酸标准液定标，当仪器再次提示定标时，用同样的方法再次注入谷氨酸标准液，直至仪器提示定标通过，然后用样品润洗微量进样器3次后准确吸取25 μL样品，在仪器提示进样品时将其快速注入反应池，测定结束后，仪器自动显示测定结果并打印。

1.4 谷氨酸检测方法评价

1.4.1 稳定性评价

定标通过后，连续10次测定同一浓度为100 mg/dL的谷氨酸标准液，对测定结果进行计算，计算相对标准偏差，评价该方法的稳定性。

1.4.2 线性评价

定标通过后，分别测定浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/dL的谷氨酸标准液，每个浓度平行测定3次，对测定结果进行计算，评价该方法的线性。

1.4.3 专一性评价

分别配制浓度为100 mg/dL的甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸标准液，用同样的方法进行检测，评价该方法的专一性。

1.4.4 加标回收率计算

分别选用5个豆豉样品A、B、C、D、E，经预处理后，从5个样品待测液中分别吸取5 mL放入试管内，再对应加入5 mL浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/dL的谷氨酸标准液，标号A1、B1、C1、D1、E1；同时，从A、B、C、D、E 5个样品待测液中吸取5 mL放入试管内，分别加入5 mL纯净水，标号A2、B2、C2、D2、E2；混匀后，对10支试管内的样品进行测定，计算加标回收率。加标回收率计算公式为：

(3)

2 结果与分析

2.1 稳定性检测结果

对同一浓度为100 mg/dL的谷氨酸标准液进行10次测定，结果见表1。

表1 生物传感器法测定谷氨酸含量

由表1可知，检测结果与实际样品浓度一致，重复测定10次，相对标准偏差为0.65%，证明本研究提供的检测方法具有良好的稳定性。

2.2 线性计算结果

对每一个浓度梯度的标准液进行3次平行测定，取平均值，将结果绘成散点图，结果见图1。

图1 谷氨酸酶电极对谷氨酸的响应

由图1可知，仪器对谷氨酸的测定具有很好的线性，线性方程为y=0.9942x+0.5262，R2=0.9999。

2.3 专一性检测结果

分别对浓度为100 mg/dL的谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸标准液用生物传感器法进行测定，测定结果见表2。

表2 生物传感器法测定谷氨酸专一性的结果

由表2可知，除谷氨酸外，其他氨基酸基本上没有响应，证明该方法对谷氨酸的测定具有很好的专一性。

2.4 加标回收率计算结果

生物传感器法所测定的5种样品的加标回收率结果见表3。

表3 生物传感器法测定谷氨酸含量的加标回收率

由表3可知，酶电极法所测定的5种样品的回收率在98.3%～100.8%之间，回收率较高。

2.5 样品浓度

采用酶电极法对超市中出售的2种品牌的豆豉中的谷氨酸含量进行测定，结果见表4。

表4 酶电极法测定豆豉中谷氨酸含量

由表4可知，2份样品中均含有谷氨酸，检出率为100%，第1份样品中谷氨酸平均浓度为8.0 mg/dL，第2份样品中谷氨酸平均浓度为12.8 mg/dL，符合样品包装对氨基酸含量的规定，与实际结果相符。第1份样品中相对标准偏差为0.61%，第2份样品中相对标准偏差为0.31%，说明酶电极法测定豆豉中谷氨酸含量具有稳定性。

3 结论

谷氨酸是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。本研究制备了谷氨酸氧化酶酶膜，借助SBA-40D型谷氨酸生物传感分析仪建立了酶电极法检测豆豉中谷氨酸含量的方法，并研究了该方法的线性范围、稳定性、专一性和回收率等性能指标，都获得了令人满意的结果。因此，采用酶电极法测定豆豉中谷氨酸的含量具有可行性，这为食品中谷氨酸含量的快速检测提供了思路。另外，该方法响应时间为20 s，所用酶膜可重复使用1000次，测定过程没有产生有毒、有害物质，符合国家绿色环保、节能减排政策。将该方法向谷氨酸生产企业推广，可缩短检测时间，减少试剂使用，提高测定结果的准确性，大大提高检测效率。