松乳菇菌株的分离鉴定及其与马尾松的互作效应

2022-10-11向健伟龙芳张立秋周家春郑威马琼

南方农业学报 2022年7期

向健伟，龙芳，张立秋，周家春，郑威，马琼*

（1湖北民族大学生物科学与技术学院，湖北恩施 445000；2恩施硒妹子葡萄酿酒有限公司，湖北恩施 445000；3湖北省农业科学院农业经济技术研究所，湖北武汉 430063）

0 引言

【研究意义】松乳菇（，Ld）属于红菇科（）、乳菇属（）真菌，俗称枞树菌，味道鲜美，营养丰富，含有丰富的松乳菇多糖，而松乳菇多糖作为一种活性成分，具有促进巨噬细胞增殖和肿瘤细胞凋亡的作用（钱叶等，2017）。松乳菇在湖北、江西、湖南、重庆、四川、贵州和云南等南方地区均有分布（林佳等，2016），主要发生在马尾松林下，常与松属植物的根系共生，是一种典型的珍稀外生菌根真菌，松乳菇子实体分化需要独特的共生生态环境及营养条件（王冉等，2020）。由于生态环境的变化，我国南方地区野生松乳菇的分布和产量急剧下降，为保护野生乳菇属真菌资源的多样性，有必要进行松乳菇菌种资源的开发、驯化与共生栽培。【前人研究进展】国内外研究者模拟自然生态条件进行了松乳菇的驯化栽培。多数研究者认为，松乳菇与其松属宿主植物间有促生作用，但松乳菇菌丝体均表现为不出菇或者出菇量低，不能真正实现规模化生产。周国英等（2003）开展松乳菇的菌种分离，获得了松乳菇菌种。辜夕容等（2005）、马琼等（2005）、杨艳美（2011）在马尾松（）根系外源接种松乳菇等外生菌根真菌，发现松乳菇等外生菌根真菌有利于培育马尾松苗木。何跃军等（2008）将松乳菇等外生菌根真菌接种柏木幼苗，证实了松乳菇对柏木幼苗促生效果较好。部分研究者认为松乳菇具有腐生性质，开展了松乳菇的腐生驯化栽培。方平夷（1994）利用棉籽壳和茅草等腐生栽培松乳菇，获得了少量松乳菇原基；詹少华（2018）利用松针和杂树叶腐生栽培松乳菇，成功实现了松乳菇栽培种菌丝体向菇蕾转化。但腐生栽培均未能获得成熟松乳菇子实体，有研究者开展了松乳菇与松属植物的共生栽培。贺谊红等（2016）在5年生马尾松林中撒播松乳菇菌丝体，探究松乳菇的半人工驯化栽培，但出菇率不高。郑华英等（2020）在松树林下驯化栽培松乳菇，获得了少量松乳菇子实体。目前，通过松乳菇与松属植物根系形成菌根，将菌根苗在野外环境下培育，人工干扰子实体的形成，是获得松乳菇的主要方法，该方法在新西兰已经成功实施，但规模驯化栽培还未实现（Gollado et al.，2019）。松乳菇不能规模驯化栽培的主要原因在于，一是松乳菇菌株分离物不纯，未进行分子鉴定，二是松乳菇特殊的共生生态条件无法满足，未获得高质量的菌根苗木，三是没有形成子实体的足够菌根化菌索及菌根。【本研究切入点】菌根化松乳菇菌索与菌根是影响马尾松生长的重要生态因子（徐江等，2012），而外源接种外生菌根真菌能增加土壤肥力，促进共生植物的生长发育（陈躬国等，2020），目前有关松乳菇与马尾松的互作效应鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用组织分离法分离湖北省恩施市境内野生松乳菇子实体，获得菌丝分离物，基于rDNA ITS序列方法分子鉴定该菌丝分离物的种属；分析外源接种松乳菇对马尾松苗木的菌根侵染率、生长指标及氮（N）、磷（P）、钾（K）元素含量的影响，对马尾松菌根侵染率与松乳菇子实体生长指标的相关性进行分析，以期为建立松乳菇与马尾松共生体系、实现松乳菇的规模驯化栽培打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种的获取与培养

试菜松乳菇子实体采自湖北恩施天然马尾松次生林，林地马尾松林龄主要为16～25年，海拔高度853～1065 m，壤土，郁闭度中等，年均降水量1400～1500 mm，年均气温14.9～16.3℃。用保鲜袋包装松乳菇子实体样本，带回实验室。在无菌条件下冲洗子实体表面，75%乙醇消毒，采用组织分离法获得松乳菇菌种。使用打孔接种器，截取2块直径6 mm的菌块，接种到新鲜制备的PDA固体培养基上，每菌接种3皿，25℃恒温培养，培养5 d后记录菌种的生长状况，利用普通光学显微镜观察菌丝的显微特征。根据菌落培养特征得到3个菌株，即松乳菇恩施-1（Enshi 1，Ld-Es-1）、松乳菇恩施-2（Enshi 2，Ld-Es-2）和松乳菇恩施-3（Enshi 3，Ld-Es-3）。

1.2 菌种的分子鉴定

采用CTAB法提取3个菌株的菌丝基因组DNA，利用乳菇属真菌rDNA ITS序列正向引物ITS1 5'-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3'和反向引物LDITS2R 5'-AGAGGAGCTGGGTCTAAG-3'（Guerin-Laguette et al.，2014），PCR扩增rDNA ITS序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收，引物合成及PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用DANMEN 8.0拼接测序序列，将拼接后的核苷酸序列与NCBI nucleotide blast数据库中已有的乳菇属真菌rDNA ITS序列进行比对。

1.3 松乳菇栽培种菌丝体的制备

首先制备离体栽培种培养基，配方为马尾松木屑14%、棉籽壳24%、稻草粉24%、玉米芯14%、干牛粪10%、珍珠岩10%、糖1.5%、石膏1.5%和磷酸二氢钾1%，调节培养基水分含量至65%～70%、pH 7.2。将栽培种培养基质装入500 mL玻璃锥形瓶，压实，封瓶口，121℃高压蒸汽灭菌2 h，待基质温度降至室温，每瓶培养基接入直径6 mm的菌块3块，每菌株接种10瓶，置于25℃培养，记录菌丝长势、污染情况及菌丝长满固体培养基质的天数，获得栽培种菌丝体。

1.4 松乳菇与马尾松共培养试验

于2020年4月初，在标准苗床中进行松乳菇与马尾松的共培养试验。将苗床分隔成若干个1 m（1 m×1 m）小区，土壤消毒，塑料薄膜覆盖7 d，分别接种3种栽培种菌丝体，接种量为400 g/m。将发芽的马尾松种子播种至苗床中，播种量为40 g/m，苗期常规管理。试验设接种无菌栽培种培养基对照（CK）和接种处理，均做3个重复。各接种处理如下：L-1处理，接种Ld-Es-1栽培种；L-2处理，接种Ld-Es-2栽培种；L-3处理，接种Ld-Es-3栽培种。在松乳菇与马尾松幼苗共培养约6个月后，随机抽取CK和接种处理的马尾松幼苗，各抽取20株，用体式显微镜（徕卡M205FA）检测马尾松根系的菌根侵染率。在共培养11个月后，随机抽取CK和接种处理马尾松苗木，各抽取20株，测定马尾松苗木的干重、株高、地径、主根长、侧根数及根系的菌根侵染率；截取CK和各接种处理马尾松苗木的根系和叶片，分别烘干、粉碎，测定根系与叶片的N、P、K的含量，其中，N含量采用凯氏蒸馏法测定，P含量采用钼锑抗比色法测定，K含量采用原子吸收分光光度法测定（张小燕，2013）。在共培养13个月后，观察CK与接种处理马尾松苗圃小区的出菇情况，统计各接种处理的出菇数量，计算平均出菇数、总鲜重、平均鲜重及松乳菇产量，其中：平均出菇数=同一接种处理出菇总数/重复小区数量；总鲜重为同一接种处理总鲜菇重量之和；平均鲜重=同一接种处理总鲜重/出菇数量；松乳菇产量=所有接种处理松乳菇总鲜重/接种处理小区总面积（1 m×9）。

1.5 统计分析

采用Excel 2013进行数据的录入及整理；运用SPSS 22.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），利用Duncan法进行多重比较分析。使用OriginPro 7.0制图。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离培养特征

由表1可看出，接种5 d后3株菌丝分离物均能在PDA培养基上良好生长。其中，菌株Ld-Es-1的长势强，培养5 d的平均菌落直径为2.7～3.1 cm，约20.00 d长满90 mm玻璃平板，老化菌丝分泌物为橘红色；菌株Ld-Es-2培养5 d的平均菌落直径为2.7～2.8 cm，约26.67 d长满90 mm玻璃平板，老化菌丝分泌物呈浅绿色；菌株Ld-Es-3培养5 d的平均菌落直径为2.4～2.5 cm，约32.00 d长满90 mm玻璃平板，老化菌丝分泌物呈乳白色。各菌株长满平板天数间差异显著（＜0.05，下同），其中菌株Ld-Es-1生长天数最短。利用普通光学显微镜制片观察3株真菌菌丝，菌丝均未见锁状联合，有隔膜。

2.2 菌株的分子鉴定

3株菌株rDNA ITS序列的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均得到520～615 bp的DNA扩增产物（图1）。将核苷酸序列在NCBI nucleotide blast数据库中与已有的松乳菇ITS序列进行同源性分析，结果得出，菌株Ld-Es-1的ITS序列与云南松乳菇KY661914.1相似度为99.65%，菌株Ld-Es-2的ITS序列与四川松乳菇KX034408.1相似度为99.12%，菌株Ld-Es-3的ITS序列与云南松乳菇KY684167.1相似度为99.45%，序列相似度均大于99.00%，因此鉴定3株菌为松乳菇。

表1 3株菌的菌落培养及菌丝的显微特征Table 1 Colony culture and microscopic characteristics of 3 strains

2.3 松乳菇栽培种的培养情况

玻璃锥形瓶因其瓶口小，内装培养基质持水性好。采用玻璃锥形瓶制备3种松乳菇栽培种，3种受试菌株均能在锥形瓶制备培养基质中实现菌丝体的生长（图2），菌丝体白色、粗壮、延伸生长良好。相比较而言，菌株Ld-Es-1菌丝生长最快，平均需要约22.60 d长满固体基质，10瓶栽培种中仅1瓶出现霉菌污染；菌株Ld-Es-3生长良好，约30.80 d长满基质，10瓶栽培种中有2瓶出现霉菌污染；菌株Ld-Es-2菌丝生长缓慢，菌丝长满瓶的时间约为37.00 d，10瓶栽培种中有4瓶霉菌污染（表2）。各菌株长满瓶固体基质所需时间差异显著，菌株Ld-Es-1所需最短。

图1 PCR扩增松乳菇菌株rDNA ITS序列Fig.1 PCR amplification of rDNA ITS sequence of L.deliciosus strains

图2 松乳菇菌株在锥形瓶中的培养情况Fig.2 Cultivation of L.deliciosus strains in triangle flasks

2.4 接种松乳菇对马尾松菌根侵染率和生长的影响

在松乳菇与马尾松共培养约6个月后，由图3可直观看出，接种处理的马尾松长势远好于CK。测定马尾松幼苗根系的菌根侵染率，结果发现，3株供试菌株处理下马尾松的菌根侵染率均在70.00%左右，马尾松根系形成外生菌根，根尖表面布满外生菌根真菌菌丝，而CK的马尾松根系未发现菌根。

在松乳菇与马尾松共培养11个月后，接种处理的马尾松菌根侵染率均在95.00%以上，显著高于CK，其中，L-1处理的马尾松菌根侵染率高达98.36%，与L-3处理差异显著（＜0.05，下同），与L-2处理差异不显著（＞0.05，下同）（表3）。

由表3还可看出，在松乳菇与马尾松共培养11个月后，接种处理表现出对马尾松生长具有显著促进作用，苗木的干重、株高、地径、主根长和侧根数均有所增加，各生长指标均与CK差异显著。与CK相比，接种处理马尾松干重增加5.41%～19.25%，株高增加11.15%～20.59%，主根长增加12.58%～28.90%，侧根数增加34.88%～46.42%，地径增加52.63%～68.42%，增幅最大。说明接种松乳菇能大幅度提高马尾松苗木各生长指标，显著改善苗木质量，其中，L-1处理的马尾松干重、株高、地径、主根长和侧根数增幅最大，效果最优。

表2 松乳菇栽培种的培养特征Table 2 Cultural characteristics of L.deliciosus cultivar

图3 松乳菇与马尾松共培养后马尾松长势Fig.3 Growth of P.massoniana after co-cultivation of L.deliciosus strains with P.massoniana

表3 接种松乳菇对马尾松生长及菌根侵染率的影响（n=20）Table 3 Effects of L.deliciosus inoculation on the growth and the mycorrhizal infection rate of P.massoniana（n=20）

2.5 接种松乳菇对马尾松N、P、K含量的影响

N、P、K等大量营养元素含量是衡量植物养分状态的一个重要指标，优良的外生菌根真菌与植物根系形成外生菌根，能活化土壤中的难溶性或难分解物质，从而促进共生植物吸收养分。由表4可知，在松乳菇与马尾松共培养11个月后，L-1处理显著提高了马尾松根系和叶片的N和P含量，但K含量与CK差异不显著。与CK相比，接种处理的根系N含量增加17.97%～44.04%，根系P含量增加13.03%～33.24%；接种处理的叶片N含量增加10.02%～45.17%，叶片P含量增加22.72%～49.84%；且马尾松叶片的N和P含量均高于根系。由此表明，松乳菇接种处理不仅有利于根系吸收土壤中N、P元素，还能促进根系养分转运到叶片。不同接种处理相比，各处理间马尾松根系和叶片的N、P含量有差异，其中L-1处理根系和叶片的N、P含量均显著高于L-3处理。

2.6 松乳菇子实体的形成及接种处理对子实体形成的影响

在松乳菇与马尾松共培养约6个月后，3个供试菌株接种处理土壤中均有白色的菌丝体，而CK土壤中没有肉眼可见的白色菌丝。在松乳菇与马尾松共培养13个月后，松乳菇接种处理各重复均出菇，而CK没有松乳菇出现，松乳菇子实体在马尾松的茎基部生长，单生，从出菇至成熟需10 d左右，共获得24个松乳菇子实体，平均出菇量为2.67个/m，产量为80.67 g/m，菇体的形态特征与其野生菌相似，进一步证实3种受试菌为松乳菇。分析3种受试菌子实体形成的差异，结果（表5）表明，L-1和L-3处理的子实体总鲜重稍高，L-2处理子实体总鲜重最低，L-1处理的总鲜重显著高于L-2处理，但松乳菇平均出菇数和平均鲜重差异不显著。

表4 接种松乳菇对马尾松根系和叶片N、P、K含量的影响（mg/g）（n=20）Table 4 Effects of L.deliciosus inoculation on N，P and K contents in roots and leaves of P.massoniana（mg/g）（n=20）

表5 不同处理松乳菇子实体形成情况Table 5 Fruiting formation of L.deliciosus in different treatments

分析各接种处理松乳菇的平均出菇数、总鲜重、平均鲜重与马尾松菌根侵染率的相关性，结果如表6所示，因接种处理各重复的出菇数差异较大，松乳菇平均出菇数、总鲜重与马尾松菌根侵染率间的相关性不显著。

3 讨论

3.1 分子鉴定对松乳菇菌种的重要性及松乳菇的营养特征

传统的真菌鉴定主要依据子实体的形态特征和菌种的培养特征，但乳菇属多个种形态特征十分相似，基于子实体形态学特征鉴别野生菌根性食用菌易受到环境和个人主观因素的影响，从该子实体分离获得的菌种培养特征鉴定也不尽科学。随着核酸分子鉴定技术的发展，rDNA ITS序列作为一种分子标记，已广泛应用于真菌鉴定（郭亮等，2011；岳万松等，2014），利用分子生物学技术结合形态学鉴定真菌，结果更准确更可靠。在本研究中，3株受试菌均能在PDA琼脂培养基上良好生长，菌落培养特征不同，rDNA ITS序列分子鉴定结果表明均为松乳菇，其ITS序列与已有的松乳菇ITS序列相似度均大于99.00%。在脱离松属植物环境条件下，利用松木屑、棉籽壳、稻草粉等木质素和纤维素含量高的原料作为离体培养松乳菇的基质，松乳菇菌丝体能实现良好生长，表明松乳菇属于兼腐生外生菌根真菌，实现其驯化栽培具有可行性（陈玉华等，2013）。

3.2 松乳菇接种与马尾松生长的关系

根际微生物对植物生长与养分吸收有重要作用，外生菌根真菌能增加根际土壤肥力，促进植物的生长发育，植株生物量、株高、地径、主根长及侧根数是评价苗木质量的重要指标（陈新等，2018）。外生菌根真菌侵染共生植物根系后，改变根系形态，增加植物根系的适应性，促进植物根系的生长，提高地径和侧根数，进而扩大根系吸收养分的面积（宋志强等，2020）。在松乳菇与马尾松共培养11个月后，3株松乳菇均显著提高了马尾松的菌根侵染率，使马尾松的菌根侵染率高达95.29%～98.36%。外源接种松乳菇大幅提高了马尾松的生长指标，尤其是地径和侧根数增加幅度较大。松乳菇显著提高了马尾松对N、P养分的吸收，且N、P在马尾松叶片中的含量分配比例高于根系，但对K养分的吸收影响不显著，该结果与松乳菇对马尾松的养分含量影响结果一致（辜夕容等，2005；杨艳美，2011）。总的来看，Ld-1处理无论对马尾松苗木的菌根侵染率、生长及N、P养分吸收影响效果均优于Ld-3和Ld-2处理。

表6 马尾松菌根侵染率与松乳菇子实体生长指标的相关分析Table 6 Correlation analysis of mycorrhizal ratio of P.massoniana with fruiting growth of L.deliciosus

3.3 共培养对松乳菇驯化栽培的影响

对于大多数菌根性食用菌而言，由于人工培养菌根苗木的外延菌丝难以形成菌索，无法分化形成子实体（冯万艳等，2019）。在本研究中，松乳菇成功实现子实体分化，表明马尾松菌根上的松乳菇外延菌丝能延伸生长，并与土壤相互交织形成菌索。但3个菌株与马尾松共培养仍表现为松乳菇出菇周期长，出菇量低。本研究中松乳菇在共生培养13个月后出菇，出菇周期较短，松乳菇产量较低，仅80.67 g/m，低于新西兰辐射松林共生栽培松乳菇的产量300 g/m（Guerin-Laguette et al，2014）。本研究中松乳菇的平均出菇数、总鲜重与马尾松菌根侵染率间的相关性不显著，原因与松乳菇外延菌丝生物量的积累不够有密切联系，外生菌根形成、菌索形成及子实体分化是一个连续的过程，土壤有机营养物质贫乏影响了松乳菇外延菌丝的生长及累积（罗佳煜等，2021），后期共生栽培需要以提高有机营养物质供给为出发点，或覆土增加小分子有机营养物质，亦或从分子水平上改造松乳菇分泌降解有机物质的酶（凡启超，2016）。今后还需要进一步优化松乳菇出菇的营养条件和培养条件，建立更为成熟的松乳菇与马尾松的共培养体系。