李思思，韩洋琳，袁文斌，杨佳，李学，吴红芝*

（1云南农业大学园林园艺学院，云南昆明650201；2云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

0 引言

【研究意义】月季（spp.）是蔷薇科蔷薇属（）植物的统称，既是世界四大鲜切花之一，也是我国十大名花之一，我国有52个城市将其选为市花，享有“花中皇后”的美誉（Debener and Byrne，2014）。月季切花居世界四大切花之首，占全球切花产业总量的三分之一以上（Cao et al.，2019），在切花市场具有重要地位。切花作为月季的主要产品形式，其采后品质直接决定了月季的观赏和经济价值。然而，随着种植规模的迅速扩大，月季灰霉病（Grey mould）危害严重，已成为月季采后最严重的病害，显著降低月季的观赏价值，被称为月季切花采后的“癌症”（张双艳等，2019）。化学杀菌剂对预防月季灰霉病发展的效果有限，也不能有效控制潜伏感染，并且病原菌易对杀菌剂产生抗药性，单纯的化学防治方法很难达到良好的防治效果（陈乐等，2020）。由于现代规模化种植中品种退化、病虫危害严重等问题，月季育种目标也由原来追求品种外在特征如花色、花型、花香、株型等扩大到其内在品质如抗病虫害、抗旱、抗寒、耐热性的提高等（张杰，2014）。因此，对月季资源进行灰霉病抗性评价，发掘优异抗病种质，对月季灰霉病的抗病育种及科学防控具有重要意义。【前人研究进展】灰霉病是由葡萄孢属真菌（spp.）引起的死体营养型真菌病害（张中义和张陶，2006），该病原菌在侵染植物时其分生孢子、分生孢子梗和菌丝可作为侵染源，侵染后期在被侵染部位形成灰色霉层，因而得名（Williamson et al.，2007）。据报道，灰霉病菌已成为继稻瘟病菌之后的第二大植物病原真菌（Hao et al.，2017），在已报道的葡萄孢属真菌中灰葡萄孢菌（）分布最广、研究最多、寄主范围最广，也是引起月季灰霉病的最主要病原菌（肖景惠等，2019）。灰葡萄孢菌感染和攻击寄主细胞的能力非常强大，孢子可随风、水、农事操作等进行传播，同时易对杀菌剂产生抗药性，在感染过程中寄主植物表面的灰葡萄孢菌分生孢子萌发长出芽管并分化发育成菌丝，诱发细胞壁降解酶、植物毒素、草酸等致病因子，使孢子进入寄主组织中，孢子在穿透寄主表皮时会产生次生代谢产物和诱导宿主细胞死亡的植物毒性蛋白，导致花瓣坏死，并在坏死花瓣表面产生大量的无性分生孢子进行再次侵染，循环往复，造成大面积感染（van Kan，2005；Hao et al.，2017；孔琼等，2020）。被侵染后的月季花瓣开始产生斑点或火燎状斑块，花瓣边缘变为褐色逐渐腐烂直至产生灰色霉层，严重影响切花品质（韩洋琳等，2021）。抗病品种的培育和推广是防治灰霉病的重要措施之一。目前国内外对月季灰霉病的相关研究主要集中在抗病分子机制揭示及抗病基因筛选方面。Liu等（2018）通过月季灰霉病菌接种花瓣进行RNA-Seq分析，揭示了油菜素内酯在月季防御灰葡萄孢侵染中的作用；Liu等（2019）对中国古老月季WRKY基因进行全基因组分析，确定为应对灰葡萄球菌感染的候选调控基因，并通过VIGS技术验证了该基因的功能；Ren等（2020）利用VIGS技术沉默和基因，提高了月季植株对灰霉病菌的敏感性，证实和基因在植株应答灰霉病菌胁迫中发挥着重要作用。近年来国内月季育种研究工作进展迅速，大量新品种被选育出来，同时还有大量优秀国外品种被引入到国内种植，但有关抗性种质资源筛选的研究相对较少（陈宇春等，2020）。Cao等（2019）通过优化花瓣圆片接种法鉴定月季灰霉病相关抗性基因时使用19个月季栽培品种进行灰霉病敏感性研究，发现不同品种对灰霉病的敏感性存在较大差异，但该研究涉及的月季品种较少，其研究也不是针对月季灰霉病抗性鉴定。【本研究切入点】前人关于月季的研究主要集中在育种技术、植株类型和观赏品质等方面，随着现代设施栽培的发展和月季采后贮运量的增大，月季灰霉病的发生和造成的损失更加严重，月季灰霉病抗性育种也越来越受到人们的关注。目前，有关月季灰霉病抗性的研究少有报道，尤其缺乏对现有优良栽培品种灰霉病抗性的系统评价。【拟解决的关键问题】采用离体花瓣接种灰霉病菌法结合2019和2020连续2年田间自然发病情况调查，对349个月季主栽培品种进行灰霉病抗性评价，筛选抗病品种；调查349个月季品种的花色、花香、茎皮刺量、花径和花瓣数等表型性状，进行表型性状与灰霉病抗性的相关性分析；选择抗病性评价结果为高抗、抗病和中抗的月季品种进行聚类分析，明确抗病性与表型性状的相关关系，挖掘抗病且观赏价值高的品种（系），为月季抗病育种及生产提供支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 月季品种供试材料为种植于云南嵩明月季DUS资源圃中的349个月季主栽品种，参考薛麒麟和郭继红（2004）的分类系统，将349个月季品种分为藤本月季（Climbers，CL）、丰花月季（Floribundas，F）、杂交茶香月季（Hybrid Tea，HT）、微型月季（Miniature，Min）、地被月季（Grand Cover Roses，R）和灌木月季（Shrubs，SH），田间调查前1个月停止使用杀菌剂。

1.1.2 灰霉病菌菌株接种菌株KMSC-011为云南农业大学园林园艺学院园林育种实验室分离纯化，通过鉴定为灰葡萄孢菌。

1.2 试验方法

1.2.1 月季灰霉病田间抗性调查2019和2020年连续2年对资源圃内349个月季品种的灰霉病自然发病情况及抗性进行调查，资源圃中每个品种10株，大垄双行栽植。根据每个品种花朵发病特征、病斑数量和大小进行病害分级。田间病害分级标准：0级，免疫，所有植株整株干净，花、茎、叶均无病斑；1级，高抗（HR），轻微感病，整朵花花瓣上出现的病斑数少于5个，且呈分散状；3级，抗病（R），花瓣上出现病斑数量少于10个，斑点面积小，且呈分散状，叶片及其他花器上无病斑；5级，中抗（MR），花瓣上斑点数较少，斑点无连片现象，叶片及其他花器上无病斑；7级，感病（S），花瓣上有大量斑点，或出现水渍状病斑；9级，高感（HS），水渍状病斑腐烂，且有灰色霉层。

1.2.2 月季灰霉病抗性离体接种鉴定

1.2.2 .1灰葡萄孢菌孢子悬浮液制备将保存的菌株KMSC-011菌饼在超净工作台中用接种针挑至新的PDA培养基上，置于24℃避光条件下活化3～5 d，然后从菌落边缘截取菌丝块接种于新的PDA培养基上，置于24℃条件下避光培养10～15 d，直至培养基上长出灰色的分生孢子，在平板上倒入5 mL 20% PDB液体培养基，用灭菌接种环刮取培养基表面的孢子及菌丝，通过双层纱布过滤掉菌丝和培养基杂质。用血球计数板测量分生孢子悬浮液浓度，使用20% PDB液体培养基将孢子悬浮液浓度稀释至1×10个分生孢子/mL备用。

1.2.2 .2离体花瓣接种灰葡萄孢菌与抗性评价采用离体花瓣接种法对供试材料的灰霉病抗性水平进行鉴定。在月季资源圃中挑选干净、无病虫害并开花至第二阶段的花枝（黄帅，2018），每个品种剪3～5支花，做好标记，带回实验室后立即插入水中备用。在接种盘内倒入无菌水，上面覆盖一层吸水纸，水不能没过纸面；取月季完整花瓣放在吸水纸上，在每个花瓣中央接种5μL的灰葡萄孢菌孢子悬浮液，盖上托盘盖，72 h后观察发病情况，测量病斑面积，根据病斑面积进行病情分级，而后根据公式转换为病情指数（DI）划分抗病等级。

病情分级参考任志华（2019）、韩洋琳等（2021）的方法并根据接种后发病情况略作修改。病情分级标准：0级，花瓣无症状；1级，0＜病斑面积（mm）≤50；3级，50＜病斑面积（mm）≤150；5级，150＜病斑面积（mm）≤300；7级，300＜病斑面积（mm）≤600；9级，600＜病斑面积（mm）。抗病等级划分标准：0级，DI=0，免疫；1级，0＜DI≤20，高抗（HR）；3级，20＜DI≤40，抗病（R）；5级，40＜DI≤60，中抗（MR）；7级，60＜DI≤80，感病（S）；9级，80＜DI≤100，高感（HS）。

1.2.3 表型性状调查方法月季5个表型性状调查参考王莉飞等（2021）的方法，均在盛花期进行调查，包括花色（Flower color，FC）、花径（Flower diamter，FD）、花瓣数（Number of petals，PN）、茎皮刺量（Number of prickle thorns，PTN）、花香（Fragrance of flower，FF）。花色参照薛麒麟和郭继红（2004）的分类方法，分为9大色系，混合色、绞色和变色统一为复色系，使用英国皇家园艺学会比色卡（RHSCC）进行测定；花径使用游标卡尺和直尺进行测量；花瓣数和茎皮刺量使用计数器进行统计。花瓣数统计（贾元义，2015）：单瓣，花瓣数（枚）≤6；半单瓣，6＜花瓣数（枚）≤15；适度丰满，15＜花瓣数（枚）≤25；丰满，25＜花瓣数（枚）≤35；非常丰满，35＜花瓣数。茎皮刺量统计：无皮刺，花茎上无皮刺；皮刺少，主干及花茎上皮刺分布稀疏，皮刺数量少，花托下方无皮刺分布；皮刺较多，主干及花茎上皮刺分布较密，花托下方小刺量少；皮刺密，花茎上分布大小不一的皮刺，数量多且密。花香由同一人在每天上午对比记录，将原始测量数据进行性状编码（表1）。

1.3 统计分析

使用Excel 2010进行数据整理，运用SPSS 19.0进行相关分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同月季资源对灰霉病的抗性评价

2.1.1 不同月季资源的田间抗性评价2019和2020年连续2年对田间种植的349个月季品种进行田间自然发病调查，综合2次调查结果，发现供试品种对月季灰霉病的抗性表现较分散，月季灰霉病的发生与种植管理水平、季节及大棚内环境湿度密切相关，不同基地、不同品种、不同季节的田间灰霉病发生差异较大，发病株率在0～100%，大部分品种易感灰霉病。月季灰霉病主要发生在花瓣、花托和茎秆上，以花瓣上发生最为普遍，染病初期花瓣上产生小斑点，病斑颜色因品种不同而异，红色和粉色品种一般表现为白色斑点，白色和黄色品种一般表现为红色斑点，而后斑点扩大连片，出现火燎状小斑或花瓣边缘变褐色或卷曲，之后病斑迅速扩展连片成水渍状，花瓣逐渐腐烂萎蔫，产生灰色霉层，若棚内湿度大，被孢子侵染的花瓣会快速发展为水渍状并腐烂，产生霉层（图1）。

如表2所示，供试月季2019和2020年总体的抗病趋势基本一致，感病材料占大多数。2019年抗病材料有126个，占供试材料的36.10%，其中17个表现为高抗，占4.87%；40个为抗病，占11.46%；69个为中抗，占19.77%；其余的223个均为感病材料，占63.90%，其中感病材料最多，有116个，占33.24%。2020年高抗材料15个，较2019年有所下降，占4.30%；42个为抗病，占12.03%；68个为中抗，占19.48%；其余的224个均为感病材料，占64.19%，其中感病材料最多，有113份，占32.38%。结合2年的调查结果，有8个月季品种2年均表现为高抗，有少数材料2年间的抗性存在差异，如芳纯和红牡丹/亚克力红2019年表现为高抗，2020年表现为抗病；和平和闪耀2019年表现为中抗，2020年则表现为感病，可能是由于当年的栽培技术、田间管控、温度、湿度及其他病虫害等因素的影响而造成的差异。

2.1.2 离体花瓣人工接种抗性评价 采用离体花瓣接种法对349个月季品种进行人工接种试验，72 h后，供试材料都不同程度地感染了灰霉病菌，病斑为近似椭圆形的黄褐色水渍状，病斑边界清晰，本次试验未发现免疫材料，不同抗病等级间病斑面积差异较大（图2），如朱红女王在72 h后病斑很小，只在接种液滴处稍扩散，平均病斑面积为6.02 mm（图2-A），而黄金奥斯曼在接种72 h后病斑面积占整个花瓣面积一半以上，平均病斑面积为1006.37 mm，且发病部位腐烂（图2-F）。

对349个月季品种的灰霉病抗性进行评价，结果（表2）显示，349个月季品种中有高抗材料11个，占3.15%；抗病材料32个，占9.17%；中抗材料64个，占18.34%；感病材料114个，占32.66 %；高感材料128个，占36.68 %。有162个月季品种的人工接种抗性评价结果与田间抗性调查结果存在差异，其中有148个品种的人工接种抗性评价结果与田间调查结果相比仅存在一个抗病等级的差异，因此一致性差异不大；有187个品种抗性评价结果一致，占53.58%，其中朱红女王、黑巴克、金色星光、桔魅（朱红女王）、费加罗夫人、帕蒂坦、爱和辉煌8个品种的人工接种结果与田间调查结果均为高抗，其病斑平均面积为22.9 mm，病情指数（DI）均在15.6以下，说明田间调查抗病性的方法可作为人工接种的辅助方法验证其抗病性，基于此结果筛选出的高抗种质可信度更高。

2.2 月季灰霉病抗性与表型性状的相关分析结果

对349个月季品种的病情指数与表型性状进行相关分析，结果（表3）显示，月季资源的灰霉病病情指数与花色、花径、花瓣数、花香不存在显著相关关系（＞0.05，下同），与茎皮刺量呈显著负相关（＜0.05），说明病情指数小的品种其茎皮刺量相对较多，抗灰霉病的月季材料茎皮刺量也相对较多。

2.3 抗灰霉病的月季资源表型性状评价

采用欧式聚类分析方法对评价为高抗、抗病和中抗灰霉病的107个月季品种的花色、花径、花瓣数、茎皮刺量和花香5个性状数据进行聚类分析，结果（图3）显示，在欧式距离为5时将107个月季品种分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等4组。第Ⅰ类31个月季品种，主要为大花香水月季，花瓣直径大，花色以粉色、红色、暗红色、紫色和复合色为主，花香较淡，多为轻香型，花瓣数较多，瓣型丰满；第Ⅱ类包括24个月季品种，主要为大花香水月季和丰花月季，花瓣直径较大，花色主要为白色、绿色、黄色及橙色，花瓣数多，较丰满；第Ⅲ类包括16个月季品种，主要为微型月季和藤本月季，花瓣直径较小，花色主要为粉色、红色、暗红色和紫色，花香主要为轻香型和无香型；第Ⅳ类包括36个月季品种，主要为大花香水月季、丰花月季和微型月季，花色主要为黄色、橙色、粉色和红色，花朵直径较第Ⅲ类大、较第Ⅰ和Ⅱ类小，花香主要为轻香和无香型。

3 讨论

3.1 月季资源抗性评价

对于病害防治，选育和使用抗病品种（系）是最经济有效的措施，而抗性材料的筛选是品种改良、种质创新及抗病育种的重要基础（陈丽等，2020；范德佳等，2020），但目前关于月季资源的抗性鉴定、抗病种质筛选、抗病指标及抗病机理等方面的研究大多集中在白粉病、黑斑病等病害，对月季灰霉病的研究相对较少（陈宇春等，2020）。不同月季资源对灰霉病具有不用的抗性水平，不同鉴定方法及植物材料种植的地理位置差异也会使鉴定结果存在分歧。本研究通过离体花瓣接种鉴定，结合2019和2020年田间抗病性调查，综合3次评价结果发现朱红女王、黑巴克、金色星光、桔魅（朱红女王）、费加罗夫人、帕蒂坦、爱和辉煌8个品种均表现高抗，未发现有免疫月季灰霉病的资源。庄得凤等（2017）对来自国内外不同地区、不同类型的349份月季资源进行了田间白粉病抗性评价，筛选出爱、春和芭比等13个高抗品种，结合本研究结果，发现月季品种爱对白粉病和灰霉病均表现为高抗，可作为抗病育种优异备选材料。

3.2 不同月季灰霉病抗性鉴定方法的差异分析

植物种质资源的抗病性鉴定通常是使用人工接种病原菌或田间自然发病情况下抗病性调查的方法进行（刘杰，2019）。本研究采用离体花瓣接种法结合田间自然发病情况调查对供试的349个月季品种资源的灰霉病抗性进行评价，发现田间调查结果与人工接种结果一致的有187个品种，大部分品种的评价差异不大，但也有Cabaret和索力多等少数几个品种的抗病评价存在较大差异，主要表现为田间调查发病情况较离体接种的严重。可能是田间灰霉病抗病性调查的品种是种植在DUS测试中心的温室内，温室中不同位置的温度、湿度、通风等因素不同均可能影响植株的病害发生，尤其是灰霉病的发生显著受温度、湿度等环境因子影响（马丹等，2009）；在温室大棚中，月季白粉病与灰霉病时常伴随发生，一般情况下月季感染白粉病后极易感染灰霉病（Williamson et al.，2007）。此外，田间灰霉菌株类型复杂，灰霉病菌种内变异丰富，有些菌株可能产生克服寄主的抗性，这些因素都有可能是田间评价与人工接种结果存在差异的原因。

侯珲等（2017）利用田间自然发病抗性鉴定法与人工接种枝条鉴定法相结合，对189份栽培种苹果种质资源进行苹果轮纹病综合抗性鉴定，发现2种方法鉴定出的结果也存在一定差异，但发现综合2种结果筛选出的高抗苹果资源更具有利用价值。蒋时姣（2019）利用田间调查及人工接种的方法对18个核桃不同品种（无性系）的黑斑病抗性进行评价，发现植株叶片接种评价可作为田间调查评价的补充，为核桃黑斑病抗性材料的筛选提供依据。田间自然发病情况下存在许多不确定因素，可在没有人为影响的条件下筛选出高抗资源，筛选出的资源可能对其他病害也具有一定抗性，其结果通过接种鉴定进一步验证保证了可靠性；人工接种鉴定可保证接种条件的一致性，且用时短，能更快、更准确地评价月季的抗病性。说明田间抗性调查结合人工接种对抗性评价结果更准确，可靠性更高，更具有利用价值。

3.3 月季资源灰霉病抗性与表型性状的相关性

作物表型性状具有直观、易于识别的特点，是作物种质资源研究和遗传分类的重要依据，通过对表型性状的鉴定和评价，可为作物优异基因资源发掘和利用提供重要信息（吴芳芳等，2020；张鸿燕等，2020）。本研究通过对月季表型性状观察，结果表明349个月季品种资源的花瓣大小及颜色等均呈现出多样性。对月季灰霉病的病情指数与花色、花径、花瓣数、茎皮刺量和花香进行相关性分析，发现月季资源的灰霉病病情指数与花色、花径、花瓣数和花香不存在显著相关，与其茎皮刺量呈显著负相关，说明茎皮刺量的多少可能与月季灰霉病抗性有关，如红丝绒、兰奇迹和卷边多头粉等品种枝刺较密，对灰霉病表现为抗病。皮刺是植物表皮或皮层形成中尖锐突起的腺毛状体，被认为是植物为适应环境而形成的一种特殊防卫组织，保护植物免受动物、病原体或机械伤害（Kellogg et al.，2011）。两面针、刺天茄和荨麻等植物的叶面刺被认为是植物对生物胁迫的防御机制，可有效抵御病原菌、昆虫和动物的伤害，具有保护植株的功能（武延生等，2021），而月季皮刺是否与植物抵御生物胁迫的机制有关，还有待进一步验证。

3.4 抗灰霉病月季种质资源表型性状评价

植物的表型性状与抗性和经济性状等相关，是评价植物抗性和生产性能的重要因素，也是生产和试验关注的主要性状（王焱，2018）。月季种质资源除具有良好的抗病性外，还应具有优异的观赏性状。李东丽等（2019）通过对306份月季材料聚类分析发现同组中花型和花色表现出高度一致性，对杂交组合以及亲本的分析发现相同花型的资源之间亲缘关系更近。本研究中，基于花色、花径等5个表型性状的聚类分析将107个抗病品种分为4大类群，通过对聚为一类的月季资源进行分析，发现月季主要品种的类别、花朵大小可能与来源存在一定关联性，部分类型一致、花朵大小相近的月季材料首先聚为一类，如第Ⅰ和第Ⅱ类群主要为大花香水月季和丰花月季，通过对其杂交组合及亲本的分析，发现大花香水月季和丰花月季由法国蔷薇（）、月季花（）和突厥蔷薇（）的杂交后代选育而来，亲缘关系更近。这2个类群的月季资源具有抗灰霉病、花朵直径大、瓣型丰满等优良特性，育种应用潜力更大。

4 结论

明确了349个月季主要栽培品种在田间和人工接种条件下的灰霉病抗感情况，筛选出朱红女王、黑巴克、金色星光、桔魅（朱红女王）、费加罗夫人、帕蒂坦、爱和辉煌8个高抗品种；月季灰霉病抗性与茎皮刺量可能存在关联性；聚类分析结果表明聚在第Ⅰ和第Ⅱ类群的月季品种具有高抗病性和花大、瓣型丰满等优良性状，具有较高的利用潜力。