陶曼芝, 吴 席, 朱香豫, 王婷婷, 贾亚峰, 曹树青

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

铁(Fe)是植物体内重要酶反应中不可或缺的催化成分,是DNA合成、呼吸和光合作用等基本过程所必需的[1-2]。虽然土壤中的铁含量丰富,但在大部分土壤中多以氧化铁的形式存在,氧化铁在氧气充足的环境中溶解度差,使土壤中可被植物直接利用的铁离子含量大大低于植物的需求[3]。植物缺铁会导致缺铁性黄化病,影响发育,同时可食用的植物也是人类的主要饮食来源,植物缺铁也会损害人类的健康[4]。据世界卫生组织称,全世界约有20亿人患有缺铁性贫血,同时缺铁也会导致儿童出现出生缺陷、运动发育迟缓和身体素质普遍下降等疾病[5]。因此,了解植物摄取铁和调节铁稳态的分子机制至关重要。

WRKY家族在拟南芥中有72个成员,在一系列植物生物学过程中,WRKY转录因子起着重要作用,包括衰老、种子发育、种子休眠和萌发、生物和非生物胁迫等以及与营养物质的吸收和转运有关。经过前期研究发现,WRKY12参与了植物调节铁稳态的过程,WRKY12功能缺失突变体对缺铁环境表现出明显的耐受性,但WRKY12基因参与植物铁稳态调控的机制并不清楚。为了进一步探究WRKY12基因的表达模式及其在缺铁胁迫下表达变化,本文拟通过构建WRKY12-GUS的转基因植株,并利用GUS染色进行WRKY12基因的表达分析,为阐明WRKY12在缺铁条件下的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

植物材料是哥伦比亚(Columbia,col) 遗传背景的野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana),从美国拟南芥种质资源中心获得,由合肥工业大学植物分子生物学实验室繁殖所得。载体构建所用质粒pART27-GUS,大肠杆菌 DH5α,农杆菌GV3101。

Plasmid miniprep Kit (TIANGEN DP103-02),T4-DNA Ligase(NEB #M0202S),限制性内切酶KpnⅠ(NEB #R3142V),XhoⅠ(NEB #R0146V),2×San Taq 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)(Sangon Biotech B639295-0080),PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa #R045),异丙醇(67-63-0),SDS(151-21-3),Tris-HCl(1185-53-1),无水乙醇(64-17-5),GT0391-50GUS染色试剂盒(华越洋)等。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥无菌苗的培养

配制 MS 固体培养基。称取蔗糖、琼脂和 MS,待溶解后调节其pH值至 5.8,封膜后用高压灭菌锅在121 ℃、101 kPa的条件下高压蒸汽灭菌20 min,灭菌后得到无菌固体培养基。用0.1%氯化汞对种子杀菌消毒后,将种子均匀点在培养基上。4 ℃ 冰箱中春化2 d,在22 ℃、16 h光照时长的培养箱中竖直培养14 d。

1.2.2 拟南芥DNA的提取

取出培养皿中培养的拟南芥,置于预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉碎后,加入400 μL SDS DNA提取液继续研磨,待充分研磨后收集至离心管中,12 000 r/min、4 ℃离心10 min后,取200 μL上清液于另一干净离心管中,加入200 μL异丙醇,12 000 r/min离心10 min,之后弃去管中的上清液,加入800 μL体积分数为70%的乙醇,12 000 r/min离心5 min。之后弃上清,将沉淀置于通风橱15 min,吹干沉淀后,加入30 μL的无菌双蒸水,冷冻保存。

1.2.3WRKY12启动区基因片段的克隆

利用Oligo 7.0软件设计以下引物进行WRKY12启动区基因片段的克隆。上游引物:ProWRKY12N-F:3’-CGGGGTACCAAAGAAA ACGAAAGGAGAATGAAGG-5’,下游引物:ProWRKY12N-R:5’-CCGCTCGAGTGTTTTT AATCTCAATCTCTCCTTGTTC-3’,以提取出的野生型拟南芥DNA 为扩增模板进行启动子克隆。

1.2.4 大肠杆菌的转化

取出于-80 ℃ 冰箱中存储的大肠杆菌 DH5α感受态细胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL连接产物加入感受态细胞中,轻轻吹打混匀,冰上放置30 min,在42 ℃ 金属浴中热激60 s,再放置于冰上静置 2 min。在热激后的感受态中加入无抗性的600 μL LB 液体培养基,放在 37 ℃ 恒温摇床中低速振荡培养 1.5 h。待培养完成后,涂布于添加了壮观霉素的LB固体培养基上。平板倒置在37 ℃恒温培养箱中培养过夜。次日挑取培养基上的单菌落,接种于添加了壮观霉素的LB液体培养基中,振荡培养6 h后进行PCR鉴定,选取阳性克隆进行测序,并对结果分析比对正确后得到具有重组质粒的大肠杆菌菌株。

1.2.5 农杆菌的转化

取出存储于-80 ℃冰箱中的农杆菌 GV3101 感受态细胞,置于冰上解冻。取2 μL重组质粒加入到感受态细胞中,混匀、吸取至已预冷的1 cm电击杯中,电击后迅速加入 600 μL 无抗性的LB液体培养基,28 ℃ 摇床培养2.5 h,涂布于同时添加有壮观霉素和庆大霉素的固体LB培养基上,28 ℃ 培养箱中培养 2 d。培养皿上挑取单菌落接种于添加有壮观霉素和庆大霉素的液体培养基中,28 ℃ 摇床培养浑浊,然后进行PCR鉴定。

1.2.6 转基因拟南芥的获得

将阳性农杆菌接种于添加有壮观霉素和庆大霉素的液体培养基中,振荡培养至OD600为1.2～1.4,离心去上清,用侵染缓冲液重悬至溶液OD600为0.8～1.2,最后加入一定量的 SilwettL-77 混匀,侵染花序,黑暗处理 12 h。隔8 d再次侵染。

1.2.7 转基因阳性植株的鉴定

将获得的拟南芥种子置于含有卡那霉素的 MS 固体培养基中进行抗性筛选,培养箱培养7 d,将具有根且子叶颜色嫩绿的幼苗移栽至土质培养基中,提取 DNA,经PCR鉴定正确后,即获得转基因阳性植株。

1.2.8 GUS染色

取叶片、花瓣、根茎等组织,于1.5 mL离心管中,加入配置好的GUS染色工作液至完全覆盖材料,用锡箔纸包裹并置于37 ℃培养箱中孵育8 h后,用70%乙醇脱去样本的叶绿素,至阴性对照呈白色,GUS染色阳性的蓝色斑点稳定,即可置于70%乙醇中保存。

2 结果与分析

2.1 拟南芥WRKY12启动子区的克隆

为了确定WRKY12基因在拟南芥响应缺铁胁迫中的作用,构建WRKY12-GUS载体。以拟南芥野生型DNA作为模板,采用PCR技术扩增片段,得到WRKY12的启动子片段,如图1所示。图1中，M代表Marker。

图1 WRKY12启动子区的克隆

2.2 目的片段和质粒双酶切

使用KpnⅠ和XhoⅠ2种限制性内切酶对WRKY12启动子片段以及pART27-GUS质粒进行酶切,得到具有相同黏性末端的片段和质粒,如图2所示。图2中，M代表Marker。

图2 WRKY12和pART27-GUS双酶切酶

2.3 重组质粒及大肠杆菌转化后阳性克隆鉴定

采用T4连接酶在16 ℃、12 h的条件下将片段连接质粒上,得到重组质粒。之后采用热激转化法将重组质粒转化到DH5α大肠杆菌感受态中,37 ℃培养过夜,挑取单克隆进行PCR鉴定,结果如图3所示。

图3中，M代表Marker;1～8分别代表转化后大肠肝菌单菌落。由图3可知,测序后选取4号阳性菌保存。

图3 大肠杆菌的鉴定

2.4 农杆菌转化及花序浸染分析

将重组质粒采用电击转化法转入GV3101农杆菌感受态中,对其进行鉴定,结果如图4所示,图4中，M代表Marker；1～7分别代表转化后农肝菌单菌落。

从图4可以看出,选取6号菌进行扩大培养,采用浸花法侵染拟南芥野生型植株,反复侵染3遍得到侵染后的种子。

图4 农杆菌鉴定

2.5 WRKY12-GUS转基因植株的抗性筛选

将得到的侵染后的种子撒在添加有卡那霉素的1/2MS培养基中,筛选得到阳性植株,如图5所示。

图5 阳性植株的筛选

2.6 ProWRKY12转基因阳性植株的鉴定

提取阳性植株中的DNA进行鉴定,结果如图6所示,图6中，M代表Marker；1～4分别代表各转基因重组植株。由图6可知,选择6号植株作为阳性ProWRKY12植株,并进一步通过抗性分离纯合所得到的阳性植株。

图6 转基因植株的PCR鉴定

2.7 纯合体的筛选

每一代植株都采用抗性分离比筛选得到阳性植株后土培繁殖,在第3代得到了纯合的ProWRKY12植株,如图7所示。

图7 转基因植株的抗性分离比

2.8 GUS染色结果分析

取ProWRKY12植株的莲座叶、花序和果荚进行染色,如图8所示,由图8可知,在花序中WRKY12基因的表达量高于在莲座叶和果荚中的表达量,具体WRKY12的表达情况还有待进一步确定。

图8 ProWRKY12阳性植株的部分组织染色图

3 结 论

全球大约1/3的可耕种土壤存在潜在的铁缺乏[6]。土壤缺铁会导致作物发育不良,进而导致人类铁缺乏病[7-8],因此解决因土壤缺铁导致的植物缺铁问题至关重要[9]。

本研究所用种子为自拟南芥种子资源中心获得WRKY12基因功能缺失型突变体,前期研究结果显示WRKY12基因参与了植物对缺铁胁迫的响应,因此通过基因工程技术构建ProWRKY12重组载体,将其转入野生型拟南芥中,从而获得转基因植株。这为研究WRKY12基因在植物中的表达模式和缺铁胁迫调节机制中的作用提供了依据,是一个非常关键的课题。

通过GUS染色分析发现WRKY12在拟南芥的莲座叶、花序和果荚中均有表达,但具体在受到缺铁胁迫后的表达变化机理还有待进一步研究。