唐 颖，李雪森

0 引 言

乳腺癌是女性癌症死亡的主要原因[1-2]。人表皮生长因子受体2(receptor tyrosine kinase 2, ERBB2，又称HER2)是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)家族中的一员[3]。HER2的扩增是介导乳腺癌发生发展的重要因素。曲妥珠单抗(Trastuzumab，TTZ)被用作治疗早期HER2阳性乳腺癌的一线治疗药物，但TTZ治疗一段时间后存在肿瘤复发与转移的风险[4-5]。有研究表明，TTZ与多种化疗药物联合使用能够达到更好的治疗效果，但存在一定不良反应，如腹泻、贫血、中性粒细胞减少、认知功能降低等[6-8]。因此，需要寻找新型抗癌药物具有适用的临床应用价值。

近年来，天然产物广泛引起了人们对发现新型抗癌治疗剂的兴趣，因为天然产物广谱多效且成本较低[9-11]。由于大多数靶向抗癌药物到目前为止未能达到预期的效果，且容易出现耐药，使用天然产物的新型多靶向治疗已成为重要的研究课题。黄卡瓦胡椒素B(Flavokawain B，FKB)是一种天然的卡瓦查尔酮，在胃癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、胶质瘤等多种癌症中都显示出抗癌活性[5,12-14]。已有大量研究表明，FKB对于肿瘤细胞毒性作用主要归因于诱导细胞周期阻滞和凋亡，其特征是激活自噬、细胞内活性氧的生成、内质网应激和促凋亡分子的上调[12-14]。本研究旨在揭示FKB对HER2阳性乳腺癌抗肿瘤作用的具体机制，以期为临床靶向HER2治疗乳腺癌提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞系人乳腺癌细胞株BT474、MDA-MB-453、SKBR3、T47D、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、ZR-75-30、SUM159 购自于中国科学院上海细胞库。FKB(纯度>95%)购自于上海吉至生化有限公司。RMPI-1640与DMEM高糖培养基购自Cytiva公司、胎牛血清购自HyClone公司、胰蛋白酶消化液购自于索莱宝有限公司。巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1，BAF，一种溶酶体抑制剂)和硼替佐米(Bortezomib，BORT，一种蛋白酶体抑制剂)购自Selleck公司。BT474细胞在含10%胎牛血清的RMPI-1640 细胞培养液中培养，MDA-MB-453、SKBR3、T47D、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、ZR-75-30、SUM159在含10%胎牛血清的DMEM高糖细胞培养液中培养，所有细胞均置于37℃、5%CO2恒温培养箱中常规培养传代。CCK-8试剂盒购自于APEXBIO公司。Western blot 试剂盒、BCA 检测试剂盒购自于碧云天生物技术有限公司。HER2抗体、AKT抗体、p-AKT抗体、GAPDH抗体均购自CST公司。逆转录与定量PCR(q-PCR)试剂盒均购自Takara公司。

1.2CCK-8 检测取对数生长期的BT474、MDA-MB-453、SKBR3细胞接种至96孔板，每孔1×104个细胞，约100 μL悬液。每组设3个复孔。FKB组根据加入相应药物处理，对照组给予最高浓度组等量的二甲基亚砜，培养48 h。读取450 nm处的吸光值(A值)。实验独立重复3次，计算增殖抑制率，公式如下：

增殖抑制率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%

1.3Western blot 检测将对数生长期的BT474、MDA-MB-453、SKBR3、T47D、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、ZR-75-30、SUM159接种到培养皿中，分别加入40 μmol/L 的FKB，作用16 h收集细胞。用含有蛋白酶抑制剂裂解液裂解细胞，提取各组细胞蛋白。BCA试剂盒检测各组蛋白浓度后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。采用5%牛血清白蛋白封闭缓冲液室温封存1 h，在4 ℃下加入相应的HER2(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶2000)一抗孵育过夜后，再与二抗常温孵育1 h，激光成像仪进行扫描，随后进行灰度值分析。

1.4总RNA提取和q-PCRFKB处理16 h后，使用 Trizol 试剂从细胞中提取总RNA，紫外分光光度计分析RNA的质量。再根据试剂盒的操作说明书进行逆转合成cDNA。q-PCR反应条件设置为：Stage 1(95 ℃,30 sec)→Stage 2(95 ℃,5 sec →60 ℃,30 sec)40 cycles→Melt Curve Stage。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt表示相对表达量。GAPDH 上游引物：AGCCACATCGCTCAGACAC 下游引物：GCCCAATACGACCAAATCC。HER2 上游引物：GACCTGCTGAACTGGTGTAT 下游引物：ACTCTGTCTCGTCAATGTCC。

2 结 果

2.1 FKB降低HER2阳性细胞的HER2表达水平Western blotting结果显示，在SKBR3 细胞中，FKB处理4 h、6 h、8 h、16 h和24 h与0 h比较，细胞HER2的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。在MDA-MB-453和BT474细胞中，FKB处理16 h与0 h比较，细胞HER2的蛋白表达水平也显著降低(P<0.05)，见图1。

图1 FKB对 HER2阳性乳腺癌细胞HER2表达水平的影响

2.2FKB抑制HER2阳性乳腺癌细胞的增殖经不同浓度FKB对BT474、MDA-MB-453、SKBR3细胞处理48 h后，3种细胞的增殖活性均受到显著的抑制。随着FKB浓度增加，细胞增殖抑制率逐渐增加，见图2。

图2 不同浓度FKB作用48 h 对 HER2阳性乳腺癌细胞增殖的影响

2.3FKB选择性抑制HER2阳性细胞AKT的磷酸化Western blot结果显示，在SKBR3 细胞中，FKB处理4h、6h、8h、16h和24h与0h比较，细胞AKT的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。在MDA-MB-453和BT474细胞中，FKB处理16 h与FKB处理0 h比较，细胞AKT的磷酸化水平也显著降低(P<0.05)。在HER2阴性细胞T47D、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、ZR-75-30、SUM159 中，FKB处理16h与FKB处理0h比较，细胞内AKT的磷酸化水平并没有发生下降，差异不具有统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 FKB分别对HER2阳性乳腺癌细胞与HER2阴性乳腺癌细胞AKT的磷酸化的影响

2.4FKB下调HER2的转录水平Western blot结果显示，BAF或BORT与FKB联合用药16 h后，与FKB相比，FKB+BAF与FKB+BORT均未能回复FKB所导致的HER2的下调，见图4。q-PCR结果显示，FKB作用BT474和MDA-MB-453细胞16 h后，其HER2的mRNA水平明显降低。FKB组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图4 FKB不通过自噬途径和蛋白酶体途径降低HER2的表达

表1 FKB对于HER2转录水平的影响

2.5FKB 通过HER2-AKT信号通路抑制HER2阳性细胞的增殖经不同浓度MK2206(一种AKT磷酸化抑制剂)处理BT474细胞48 h，细胞的增殖水平受到显著抑制且呈浓度依赖性，见图5。BT474细胞经无血清培养基饥饿过夜后，再由不同浓度EGF处理48 h，CCK8结果显示，与0 ng/mL EGF(100±10)相比，20、40、60、80 ng/mL EGF增殖水平(180±17、150±1、162±25、152±8)显著增加(P<0.05)。FKB或MK2206 与EGF联合作用48 h，CCK8结果显示，与EGF(193±3)相比，FKB+EGF(60±13)与K2206+FKB(108±21)均能抑制EGF诱导的细胞增殖水平的增加(P<0.05)。在蛋白水平上，细胞采用无血清培养基饥饿过夜后，再由40 ng/mL EGF分别作用不同时间，Western blot结果显示，与0h EGF相比，0.5 h、1 h和2 h EGF细胞内AKT的磷酸化水平显著升高。随后先用FKB或MK2206处理细胞1h，再加入EGF联合作用1 h，Western blot结果显示与EGF相比，FKB+EGF与MK2206+EGF均能抑制EGF诱导的AKT磷酸化的上调，见图6。

图5 不同浓度MK2206作用48 h对 HER2阳性乳腺癌细胞增殖的影响

图6 FKB与MK2206抑制EGF诱导的AKT磷酸化

3 讨 论

已有研究报道，FKB对于多种肿瘤细胞都具有抗肿瘤作用[15-18]。FKB通过靶向SKP2的类泛素化促进其降解从而增强硼替佐米的抗前列腺癌作用[13]。JAE等证实FKB和柔红霉素通过修饰NF-κB诱导人髓系白血病细胞凋亡[19]。上述已有的研究结果表明，FKB在不同的癌症类型中发挥抗肿瘤作用的机制存在差异，并且在乳腺癌中其作用靶点仍不明确，因此阐明FKB抑制乳腺癌细胞增殖的具体机制是必要的。

AKT是HER2下游一个重要的靶点，HER2-AKT通路的异常激活可促进细胞存活，肿瘤进展和增加恶性程度。虽然针对HER2已开发了多种药物，包括Lapatinib,、Neratinib、TTZ等，但用药一段时间后存在耐药问题，这不仅影响肿瘤治疗反应，也阻碍了HER2常规抑制剂的临床应用[20]。AKT的活性在HER2阳性乳腺癌中经常被放大，可促进HER2阳性乳腺癌的发生发展[21]，并且HER2靶向治疗的耐药也与PI3K-AKT-mTOR通路的异常激活有关[22-23]。因此，新的靶向药物的出现具有实用的临床价值。据文献报道，HER2没有结合已知配体的能力，不能结合任何已知的生长因子[24]。HER2需要与另一配体激活的ERBB受体形成异二聚化来介导信号传导[25-26]。为了探讨HER2激活后FKB对细胞增殖的影响，因此我们采用表皮生长因子EGF激活EGFR，活化的EGFR与HER2形成异二聚体进而激活HER2下游的信号通路。本研究实验结果显示EGF能够显著促进细胞的增殖，AKT磷酸化抑制剂MK2206可以抑制细胞的增殖并呈浓度依赖性，并且MK2206可以在一定程度阻断EGF的促增殖效应，该结果在一定程度上表明HER2-AKT信号通路的激活可以促进乳腺癌细胞BT474的增殖。进一步研究发现FKB和MK2206可以显著抑制EGF诱导的细胞活性的增加和p-AKT的上调。Q-PCR结果显示FKB显著下调了HER2 mRNA的表达，Western blot结果显示FKB在蛋白水平下调HER2的表达与转录水平相一致。基于以上实验结果，我们推测HER2-AKT信号通路的激活可以促进乳腺癌细胞BT474的增殖，FKB可在转录水平降低HER2的表达进而下调AKT的磷酸化，抑制HER2-AKT信号通路，从而发挥其抗癌作用。值得注意的是，本研究发现，不同于HER2阳性的乳腺癌细胞，HER2阴性的乳腺癌细胞在FKB作用后，AKT的磷酸化水平并没有发生下降，这也提示FKB靶向HER2-AKT信号轴来发挥抗肿瘤增殖作用。Nadiah 等发现FKB处理后MDA-MB-231细胞的p-AKT水平明显升高[27]。Nadiah 等[28]的实验结果与我们结果相符，即不同HER2状态的乳腺癌细胞p-AKT的调控机制存在差异，并且我们推测部分HER2阴性细胞在FKB处理后出现p-AKT上调可能与FKB处理后细胞处于应激状态并激活KRAS有关，因为先前的研究表明在KRAS激活的情况下，KRAS以一种不依赖于RTK(Receptor tyrosine kinases，受体酪氨酸激酶)的方式激活AKT信号。另外，Chang等[12]发现FKB可以通过诱导自噬来抑制HER2表达和PI3K-AKT-mTOR信号通路从而抑制人胃癌细胞株AGS和NCI-N87的增殖。这与本研究所观测到的结果存在差异，本研究发现在乳腺癌中FKB可通过下调HER2的转录水平进而抑制AKT的磷酸化，这提示FKB在不用的肿瘤类型中抑制HER2表达的机制有所差异，FKB在乳腺癌中下调HER2 mRNA水平的具体机制目前尚未可知，我们将会在接下来的研究工作中深入探讨。

综上所诉，FKB通过调节HER2-AKT经典信号通路来降低BT474细胞的增殖能力。因此HER2-AKT信号通路相关蛋白可能成为FKB治疗HER2阳性乳腺癌的潜在靶点。本研究为探索FKB抑制HER2阳性乳腺癌细胞增殖的机制提供了科学的理论与实验依据，并为临床靶向HER2阳性乳腺癌的治疗提供新的思路。