谢晓露陈 秀寇利秋李亚玲*

(1.西南医科大学附属医院药学部,四川 泸州 646000;2.西南医科大学药学院,四川 泸州 646000)

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性记忆力下降、认知功能障碍、行为异常和人格失常等为主要临床表现的神经退行性疾病[1]。AD的典型病理改变包括神经元丢失、β-淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque,SP)及tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)等[2]。全世界约3000多万人患有AD,到2050年预计其患病人数将达1.15亿[3]。据美国阿尔兹海默协会统计,AD已成为美国第六大致死原因,其导致的死亡人数从2000到2019年间增加了145%以上,在2021年造成的经济损失高达3550亿美元[4],给患者及其家属带来巨大的经济负担和身心压力。到目前为止,临床上还没有任何一种有效的方法能治愈或有效的预防和缓解此病的发生发展,主要是因为AD病因多样、病机复杂。因此,阐明AD发病机制、探索治疗AD药物是脑科学研究的重要课题。在医学研究中,根据疾病构建动物模型对疾病发生机制、治疗评价、前沿研究有着极为重要的意义,故而寻求一种合适的动物模型来模拟AD患者的病理特征和临床表现及选择恰当的方法来评估模型相关指标就十分重要。本文通过总结目前国内外常见AD动物模型及其相关指标的评价方法,以期为相关课题的研究选择合适的动物模型和评价方法做参考,并为构建新型动物模型和发展新的模型指标评价方法提供新思路。

1 国内外常见AD动物模型的构建

目前,国内外常见AD动物模型分为转基因AD动物模型和非转基因AD动物模型。转基因AD动物模型是通过重组DNA技术,将一个或多个外源性突变基因整合到动物的基因组中,从而表达AD的某些特征。常引入的突变基因包括淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因、早老蛋白(presenilin,PS)基因和tau蛋白基因等。非转基因AD动物模型主要通过注射Aβ或tau蛋白、化学物质损伤胆碱能神经或致神经炎症、金属灌胃、老化、破坏肠道菌群平衡和物理手段制作而成。

1.1 转基因AD动物模型

根据模型所表达的AD主要病理特征和使用动物,目前转基因动物模型分为APP与PS转基因小鼠、tau转基因小鼠、APP/PS/tau转基因小鼠、特殊转基因小鼠、基因敲入小鼠和转基因大鼠。

1.1.1 APP与PS转基因小鼠

APP为一种Ι型跨膜蛋白,由21号常染色体上的APP基因编码,该基因上有25个与AD相关突变,常用的包括印第安纳突变(V717F)、瑞典突变(K670N/M671L)和伦敦突变(V717I)。PS基因分为14号常染色体上的PS1和1号常染色体上的PS2,目前对PS1的研究居多。这可能是因为PS1在脑内的表达量更高,表达PS1的小鼠发病年龄更早且疾病进展更为快速[5]。虽然PS单转基因小鼠能形成AD相关的神经元和突触丧失及血管病变,但不能形成淀粉样斑块,而将PS突变基因引入APP转基因模型后,Aβ和斑块显著表达。

根据模型所携带的突变基因种类和数量,APP与PS转基因小鼠可分为APP单转基因小鼠、APP双转基因小鼠与APP/PS转基因小鼠。这些模型以Aβ斑块与认知和记忆功能障碍为主要特征,但因模型所携带的突变基因和启动子不同,在形成时间和部位上有所差异,具体见表1。APP单转基因小鼠至今已使用二十多年,特性明确,在繁殖与管理上更加简便,但出现AD特征的时间较晚。APP双转基因小鼠与APP/PS转基因小鼠虽然大多能相对较早地表现AD特征,但由于这些小鼠多为两种携带单个或两个突变基因小鼠杂交而来,遗传背景的改变可能会对实验结果产生影响。

表1 常用APP与PS转基因小鼠Table 1 Commonly used APP and PS transgenic mice

1.1.2 tau转基因小鼠

tau转基因小鼠通过表达tau蛋白突变基因P301L和P301S,出现过表达的tau蛋白、NFTs、脑萎缩和行为障碍等,主要用于tau蛋白和治疗药物的相关研究。此类模型主要形成与额颞叶痴呆和帕金森病相关的tau蛋白病理,因此突变基因产生的tau蛋白在毒性和初始形成部位上与AD患者有差异,并且在小鼠上观察到未在AD患者中出现的明显的tau蛋白相关行为障碍[12]。

1.1.3 APP/PS/tau转基因小鼠

为了更全面地模拟AD特征,通过杂交或转入APP/PS/tau突变基因,研发出了能产生淀粉样斑块和NFTs的小鼠。这些小鼠与表达单一突变基因的小鼠相比,无论是在淀粉样斑块或NFTs的产生时间、面积或是数量上都占有一定优势。但是淀粉样斑块的产生通常明显先于NFTs。本类模型中,3XTg小鼠使用较为广泛,其携带PS1M146V、APPSwe和tauP301L突变基因,在6月龄便出现淀粉样沉积、神经炎性变、记忆和认知障碍,12月龄形成NFTs[13]。近来将5XFAD小鼠与tauP301L小鼠杂交得到的6XTg小鼠较5XFAD小鼠具有明显优势,在2月龄时出现更加显著的淀粉样斑块,4月龄时在皮质与海马体中的形成NFTs,认知和记忆缺陷也更早出现[14],但还需要更多的实验证据支持和完善。

1.1.4 特殊转基因小鼠

一些转基因模型能特异性地表达AD某种特征,如Tg-SwDI小鼠和Aβ-GFP小鼠。Tg-SwDI小鼠表达APPSwe693Q/D694N突变基因,在3月龄时出现纤丝血管Aβ的大量积累和较不明显的弥漫性实质斑块,可用于CAA研究[15]。Aβ-GFP小鼠携带人Aβ1-42与GFP融合蛋白的DNA片段,在鸡β-肌动蛋白启动子的控制下,能在神经细胞内高表达Aβ寡聚体[16]。

1.1.5 基因敲入小鼠

为了避免上述转基因模型的突变基因过度表达导致产生人为表型和影响疾病相关基因表达的研究,研发出了更为生理化的模型,即基因敲入小鼠。此类模型包括hAβ基因敲入小鼠、APP基因敲入小鼠、htau基因敲入小鼠和APP/tau双基因敲入小鼠,具体见表2,可用于临床前AD相关基因分子病理研究与AD预防研究。

表2 基因敲入小鼠Table 2 Knock-in mice

1.1.6 转基因大鼠

转基因大鼠也能表现出AD特征,与小鼠相比,在生理、基因和形态学上更接近人类,具有更加复杂的行为表现,脑部操作更容易[20]。但因其制作更加困难,有着更高的工艺要求而使用较少。TgF344-AD大鼠和McGill-R-Thy1-APP大鼠较常使用,前者通过表达APPSwe/PS1ΔE9突变而呈现AD完整的病理特征[21],后者通过表达APPSwe/V717F突变出现明显的认知行为障碍[22]。

1.2 非转基因AD动物模型

1.2.1 Aβ或tau蛋白损伤模型

脑内注射Aβ或tau蛋白能快速产生AD病理模型,大鼠因体积大、在海马和脑室注射更加方便而最为常用。在单侧或双侧海马注射Aβ,短期内出现显著的记忆力下降、Aβ沉积和磷酸化tau蛋白[23],用于研究SP所致的记忆障碍和神经炎性病变以及Aβ亚型在AD病变过程中的作用。当注射tau蛋白时可产生NFTs样结构,并会加快tauP301S、5XFAD小鼠模型病理特征的形成[24-25]。这些模型虽能快速形成AD病理,但需反复注射达到稳定,很容易因注射不当导致Aβ或tau蛋白难以扩散至脑内,使局部浓度过高,造成局部损伤。

1.2.2 化学物质损伤胆碱能神经或致神经炎症模型

该类模型以啮齿类动物造模最为常见,少数研究使用斑马鱼和非人灵长类动物。根据化学物质造模的主要机制分为神经炎症模型和胆碱能神经损伤模型,具体见表3。这些模型多采用腹腔或脑室注射的方式构建,建模成功与否很大程度上与注射规范程度和化学物质浓度相关。该类模型操作简单,成模时间较短,但都难以形成NFTs。

表3 化学物质损伤胆碱能神经或致神经炎症模型Table 3 Chemical substances damage cholinergic nerves or cause neuroinflammatory models

1.2.3 铝损伤模型

铝损伤模型通过AlCl3灌胃致使小鼠出现学习和记忆功能障碍[31]。该模型制作简单,经济,但只能表现单一的AD特征。通常与其他造模方法结合以加快AD病理形成。

1.2.4 老化模型

包括诱导老化模型、快速老化模型与自然衰老模型,具体见表4。诱导老化模型通过D-半乳糖诱导大鼠或小鼠产生,具有价格低、操作简单、可重复性高的优点。快速老化模型以AKR/J小鼠作为祖先近交繁殖得到,具有实验周期短,学习和记忆障碍的发生较诱导老化模型更加自然等优点,但发病机制复杂,对于单一机制的研究不太适宜。自然老化模型以非人灵长类动物或啮齿类动物自然衰老构建。非人灵长类动物最接近生理化,能表现出SP,且大多能出现CAA,与人类迟发型AD最为相似。与非人灵长类动物相比,啮齿类动物实验周期更短,相对更加经济且省时省力。

表4 老化模型Table 4 Aging models

1.2.5 人源性肠道菌群模型

朱华等[36]将AD患者粪便移植到小鼠体内,能表现出与AD患者相类似的肠道菌群结构,无SP,可用于菌群与AD关系、相关微生态制剂评价。

1.2.6 物理损伤模型

此类模型通过物理手段造成机体损伤,进而发展出AD相关的病理特征。如手术摧毁双侧海马穹窿伞出现学习和记忆功能障碍[37];长期脑缺血老年小鼠出现明显的脑组织萎缩与认知行为障碍[38]。但上述模型均无SP和NFTs,且造模成功率较低。

2 AD动物模型相关指标评价方法

认知与记忆功能障碍、核心生物标志物(Aβ和tau蛋白)与主要病理特征是否出现是评价动物模型制作成功与否的3个关键指标。认知与记忆功能障碍通过对实验动物行为的评价而间接确定,核心生物标志物与主要病理特征通过免疫学或影像学方法确定。

2.1 行为学方法

常用的包括Morris水迷宫、Y型迷宫、Barnes迷宫、条件恐惧实验(fear conditioning,FC)、新物辨别实验(novel object recognition test)、旷场试验(open field test),具体见表5。

表5 六种行为学评价方法Table 5 Six behavioral evaluation methods

2.2 免疫学方法

常用的包括免疫组织化学染色、免疫荧光染色、免疫印迹分析(Western blot)与酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。

免疫组织化学染色与免疫荧光染色主要操作步骤基本一致,经过组织切片的制备、抗原修复、双抗孵育、显色剂染色或抗荧光衰减剂封片,最后使用光学显微镜或荧光显微镜进行观察,记录目标抗原的分布与数量。这两种方法常用于肿瘤的病理组织观察分析。在AD动物模型应用上,常使用单克隆抗体(如2G3、21F12、3D6、8E5、BS42、AT8等)、抗氧化应激抗体、大鼠抗小鼠CD45抗体与牛抗小鼠GFAP抗体等用于APP、Aβ肽及其各种多聚体、SP、氧化应激、tau蛋白及磷酸化tau蛋白、小胶质细胞、星形胶质细胞等的定位或定量分析。这两种方法应用较为广泛,能可视化地对病理组织进行分析,虽然使用二抗间接标记提高了方法的灵敏度和准确性[44],但传统方法仍面临着抗体种属来源少,只能同时标记一到三种标记物与染料重叠带来的信号识别等问题[45]。

Western blot和ELISA主要用于蛋白质的定量分析,在低浓度蛋白的检测上更为敏感,具有更高的准确性与精确性。在AD模型的研究上,Western blot和ELISA用于APP及其蛋白水解产物、突触蛋白、tau蛋白等的定量检测,后者还用于白介素、碱性成纤维生长因子的定量分析。Western blot主要操作步骤包括脑组织匀浆制备、BCA法蛋白定量、凝胶电泳与湿法转膜、双抗孵育、化学发光显影与定影及测定蛋白表达。该方法操作复杂繁琐,实验变量多,结果不稳定,需要耗费大量时间与精力探索实验条件[46]。ELISA操作较为简单,分为间接ELISA和竞争或阻断ELISA,主要包括制备脑组织匀浆、双抗孵育、加入底物与酶结合成色,酶标仪测试OD值。该方法不足之处在于会因显色不明确导致假阳性结果,或因与平板非特异性结合导致高阳性结果[47]。

2.3 影像学方法

分子影像学方法即在分子和细胞层面对活体生物进行无创或微创的生物学过程的成像分析,主要用于肿瘤、冠心病等方面的诊治。在AD动物模型的应用上,常使用核磁共振成像(MRI)、功能磁共振成像(fMRI)、正电子发射断层扫描(PET)、荧光成像等对实验动物海马、大脑皮层、小脑、灰白质宏观与微观结构变化或淀粉样斑块进行评估。Sidiqi等[48]利用姜黄素进行荧光成像发现小鼠视网膜上淀粉样斑块可作为脑中淀粉样斑块用于AD早期诊断的替代。影像学方法具有灵敏性高、分辨率好等特点,但价格偏高,荧光成像相对便宜。

3 总结与展望

多年来,研究人员已利用转基因技术与各种理化方法制备了大量的AD动物模型,各模型各有特点,但都无法完美复刻人类AD:转基因动物模型具有复杂的生化、病理和认知行为学特征;采用理化手段制备的非转基因动物模型在进行单一致病因素导致的认知行为障碍相关研究上更具优势,且更具经济性;非人灵长类动物与人类具有遗传相似性,其病理生理发展过程和人类迟发型AD更相似,但受限于经济、伦理、表型和病理出现时间不一致等问题而较少进行相关研究[34];基因敲入小鼠可能是更具代表性的生理化AD模型,但仍需在未来的研究中进一步证实。这些模型被广泛用于AD发病机制、影响因素和治疗药物的开发与验证中,并在药物临床前研究中取得了不错的成绩。但这些成果在临床的转换率却较低,可能是因为AD复杂的病因和病机及实验动物与人类间的种属差异,即使实验动物表现出相似的病理与症状,复杂的内在机制却有所差别。而将人类干细胞来源的神经细胞移植到啮齿类动物大脑中可能解决上述问题,得到最接近生理的AD动物模型,但难以用于研究免疫系统和神经间的相互作用,故该方法仍需未来的进一步开发研究[49]。鉴于此,在进行AD相关研究时有必要根据各种建模方法的特点将多种方法结合进行动物模型的构建,或者在多个动物模型中进行研究,以确保临床前研究成果最大可能地转化为人类临床试验。在评定所制备的模型是否达标上,未发现统一的评价标准。并在对同一模型评价时,同一指标对不同方法的敏感性有所差异导致评价结果不同。因此,建议选用多种方法配合,如选用1～2种行为学方法评价认知与记忆功能以及2～4种免疫学或影像学方法评价脑内核心标志物和组织病理特征。