许 康白 丽

(1.大理大学基础医学院,云南 大理 671000;2.大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南 大理 671000)

免疫检查点抑制治疗是当下肿瘤免疫治疗的一颗明星,随着细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)以及程序性死亡受体1(programmed cell death-1,PD-1)的研究的不断推进,其免疫阻断剂已经批准上市并在治疗部分实体瘤取得一定成果[1-2]。但现今仍有大量的癌症对以上免疫检查点抑制无效或低应答,因此新的免疫检查点研究势在必行。T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3,TIM-3)起初被认定为产生IFN-γ的Th1细胞和Tc1细胞的表面标记分子[3]。随着研究的不断深入,发现TIM-3具有多种功能,如TIM-3表达水平与自身免疫性疾病密切相关;在肿瘤微环境中,TIM-3不仅调节T细胞、NK细胞衰竭,同时也调节巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)介导肿瘤发生固有免疫逃逸[4-5]。本文就近几年研究发现,阐述TIM-3分子及相关配体的表达与作用,TIM-3参与的肿瘤免疫逃逸和TIM-3抑制剂抗肿瘤研究,并对未来研究工作作出展望。

1 TIM-3分子及其配体

1.1 TIM-3

人类TIM-3基因定位于5q 33.2染色体,有1116个核苷酸,编码301个氨基酸,与TIM-1、TIM-2、TIM-4共同构成TIM基因家族[4]。所有TIM家族成员的IgV结构域都包含6个Cys残基,第一个与最后一个链接形成β折叠,其余4个形成两个二硫键,将CC’环固定在GFCβ面上,形成TIM家族独特的结构特征,同时,CC’环与FG环平行,构成口袋样结构[6]。TIM-3分子由胞膜外富含半胱氨酸的氨基末端球蛋白可变结构域、粘蛋白、跨膜结构域和胞质区构成[4,6]。TIM-3与配体结合的主要部位是细胞膜外可变结构域,其与配体相互作用后进行抑制信号转导,引起T细胞、NK细胞等的衰竭与凋亡,进而导致肿瘤免疫逃逸的发生发展;同时,TIM-3能抑制自身免疫性疾病和介导移植免疫耐受,若阻断TIM-3将可能导致移植排斥反应和自身免疫性疾病的发生[4,6-7]。

1.2 Galectin 9

TIM-3分子的主要配体是半乳糖凝集素9(Galectin 9,Gal-9),两者结合后通过钙-钙蛋白酶-caspase-1负反馈调控途径导致T细胞的凋亡,从而促进肿瘤的生长[8]。Gal-9广泛分布于多种组织器官,且在免疫细胞和部分实体瘤中高度表达[9]。Gal-9的产生受IFN-γ调控,IFN-γ是Th1细胞产生的主要细胞因子,TIM-3/Gal-9通路是TIM-3+Th1细胞负反馈调节的途径之一,Th1细胞的死亡也是IFN-γ下调的一个重要因素[5,10]。在慢性淋巴细胞白血病的研究中发现,患者Treg和Th17细胞上TIM-3高表达,Gal-9在血清中的水平升高,且Binet分期越晚越明显,TIM-3与Gal-9结合形成的负调控通路诱导了肿瘤免疫逃逸[11]。最近一项研究发现,Gal-9在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者中的基因突变导致了TIM-3+CD8+T细胞的衰竭,这与DLBCL患者的预后不良有关[12]。阻断Gal-9与TIM-3之间的结合是提高患者生存率的有效手段之一。

1.3 HMGB1

高迁移率族蛋白B1(high-mobility group protein B1,HMGB1)是非组蛋白成分,位于细胞核内且具有促进转录作用,当发生细胞损伤、细胞凋亡以及免疫细胞或癌细胞受到刺激时被释放到内环境,参与炎症反应以及肿瘤免疫等[4,13-14]。HMGB1能促进多种癌症的迁移和转移,如乳腺癌[15]、非小细胞肺癌[16]、肝细胞癌[17]、前列腺癌[18]、结直肠癌[19]。在Chiba等[20]的研究中发现,在肿瘤微环境中,肿瘤浸润性DC高表达TIM-3蛋白,与肿瘤细胞释放的核酸竞争结合HMGB1,阻止核酸进入内体,从而抑制核酸刺激固有免疫反应,因此,固有免疫细胞的激活和功能受损。阻断HMGB1与TIM-3的相互作用可增强固有免疫反应的抗肿瘤作用。

1.4 CEACAM1

癌胚抗原相关细胞粘附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1,CEACAM1)是在癌细胞和正常细胞都有不同程度表达的Ⅰ型跨膜蛋白,当其在活化T细胞上表达时主要参与抑制T细胞活化[21]。根据肿瘤的不同,CEACAM1有着不同的作用,CEACAM1是乳腺癌瘤周血管生成的重要分子;其在前列腺癌发育不良上皮细胞中表达下调预示着肿瘤向侵袭性和血管化转变;同时,CEACAM1可作为非小细胞肺癌、胰腺癌有效的预后标志物[22-23]。根据Huang等[24]的研究,它与TIM-3在活化T细胞上共表达,并形成异二聚体或以反式的形式相互作用诱导耐受。在小鼠结肠癌模型中表明,联合阻断TIM-3和CEACAM1可提高肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中CD4+、CD8+T细胞的数量并上调IFN-γ的分泌,提高肿瘤清除率[24]。但最新研究发现,CEACAM1在顺式和反式都与TIM-3没有明显相互作用,仅作为T细胞表面的抑制分子参与T细胞活化的抑制,这两种受体并不相互调节彼此的功能[25]。基于以上研究,CEACAM1是否作为TIM-3配体以及两者之间的联系还有待进一步深入了解。

1.5 磷脂酰丝氨酸

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PtdSer)是TIM-3所有已知配体中亲和力最低的[13]。PtdSer的结合位点为FG-CC’口袋样结构,其参与促进TIM-3的磷酸化,并通过干扰PI3K信号传导,导致肿瘤滤过性肝驻留NK细胞和普通NK细胞功能障碍[26]。此外,PtdSer与TIM-3的结合可介导凋亡细胞的清除并有助于抗原交叉呈递[27]。在Weber等[28]的研究中,PtdSer与TIM-3的结合导致后者的构象发生变化,但仍不清楚这种构象变化是否与免疫细胞的衰竭有关。

2 TIM-3参与的免疫细胞介导的肿瘤免疫逃逸

TIM-3表达比较广泛,NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、FoxP3+Treg细胞、癌细胞、肿瘤干细胞、髓细胞等都有TIM-3的身影,其表达于免疫细胞且未与配体结合时,主要参与维持细胞的活化,与配体结合后进行免疫负反馈调节,抑制免疫细胞功能;在癌细胞上表达时,参与肿瘤的生长、浸润与转移[4-5,27]。现对TIM-3在不同免疫细胞上的表达和介导的肿瘤免疫逃逸进行阐述。

2.1 TIM-3与T细胞

TIM-3在T细胞上的表达主要局限于分泌IFN-γ的CD4+、CD8+T细胞,以及FoxP3+Treg细胞[13]。当T细胞活化时,TIM-3从胞质内被募集到胞膜上免疫受体,并通过细胞质尾部的Tyr256和Tyr263与BAT3结合,募集酪氨酸激酶LCK,维持T细胞的活化,当有配体与TIM-3结合时,通过酪氨酸激酶ITK激发Tyr256和Tyr263磷酸化,使BAT3被释放,LCK不再被募集,导致T细胞失活,TIM-3发挥抑制作用[4]。

虽然TIM-3介导的T细胞活化抑制的相关下游信号通路及具体的信号传导机制仍不是十分明确,但越来越多的研究认为,TIM-3是TIL T细胞衰竭的标志物。Shariati等[29]通过流式细胞术分析乳腺癌患者引流淋巴结中CD4+、CD8+T细胞TIM-3的表达水平发现,其与乳腺癌分级以及预后不良的指标相关。Yun等[30]使用毛喉素使细胞cAMP水平升高,激活其下游蛋白EKA和EPAC的表达,从而上调Jurkat T细胞中TIM-3的表达,并发现肿瘤细胞分泌的PGE2与受体EP4相互作用也增加了TIM-3的表达,造成T细胞衰竭,肿瘤发生侵袭和转移。T细胞的衰竭是造成肿瘤免疫逃逸的一个重要因素。

2.2 TIM-3与巨噬细胞

TIM-3基因的高表达能诱导巨噬细胞极化为交替活化巨噬细胞,即M2型,促进肿瘤的发生发展,而TIM-3基因沉默则诱导巨噬细胞极化为经典活化巨噬细胞,即M1型,发挥抗肿瘤作用[31]。在HCC的研究中发现,肝肿瘤微环境中TGF-β的表达增强了TIM-3的分子水平,进一步促进IL-6的分泌,导致HCC的生长[32]。该项研究还指出,TIM-3在外周血单核细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的表达较高,并与患者生存率相关,在阻断或敲除TAMs中的TIM-3后,抑制了诸如GM-CSF、IL-10、IL-6这些促肿瘤生长细胞因子的分泌。这些结果表明TIM-3抑制了巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应,为肿瘤免疫治疗提供了新的方向。

2.3 TIM-3与NK细胞

TIM-3的表达是NK细胞发育成熟的标志,TIL中NK细胞的TIM-3表达水平虽然较高,但同样存在功能性衰竭[26,33]。在晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌和膀胱癌患者的外周NK细胞中,可观察到TIM-3高表达并存在细胞衰竭,通过阻断TIM-3可恢复细胞毒性,但在肿瘤内的NK细胞无法通过阻断TIM-3恢复活性[33]。So等[34]发现,不同刺激源均能上调NK细胞表面TIM-3的表达,刺激活化的NK细胞在功能性上有一定区别,这些区别表现在CD56和INF-γ的表达水平等,提示TIM-3的阻断可能影响NK细胞的活性。目前,NK细胞上TIM-3的功能和参与免疫抑制的机制还有待进一步研究。

2.4 TIM-3与DC

TIL DC能在肿瘤细胞及其微环境中的各种因子诱导下产生吲哚胺2,3-脱氧酶、精氨酸酶Ⅰ、TGF-β1、IL-10、VEGF等促进肿瘤细胞生长的因子,同时高表达TIM-3,并与配体HMGB1结合后抑制了由核酸介导的固有抗肿瘤免疫,造成肿瘤在固有免疫中的逃逸[20]。在有关乳腺癌的研究中,TIM-3在CD103+DC上高度表达,运用抗TIM-3抗体联合紫杉醇治疗小鼠乳腺癌模型可观察到肿瘤生长得到抑制,并使DC表达CXCL9,增强了CD8+T细胞的细胞毒性[35]。虽然DC表面TIM-3的相关研究有限,但为化疗依赖性患者提供了一种有效策略。

3 抗TIM-3的肿瘤免疫治疗

越来越多的研究表明TIM-3是肿瘤免疫治疗的一个主要靶点,其与其他免疫检查点联合阻断取得了一定成果。基础研究方面,TIM-3抑制剂可阻断TIM-3/Gal-9信号,在体外恢复衰竭的γδT细胞活性,与抗CD3/抗EpCAM双特异性抗体MT110联合使用后增强γδT细胞毒性,并在过继输注时增强γδT细胞靶向性及抗肿瘤活性[36]。在小鼠肺癌模型中,溶瘤病毒vvDD联合PD-1、TIM-3阻断表现出较强的协同作用,肿瘤体积显著减少,小鼠生存率大大提高[37]。TIM-3阻断联合紫杉醇在乳腺癌中的治疗效果前文已述[35]。抗TIM-3单抗M6903可阻断TIM-3与Gal-9、CEACAM1、PtdSer的结合,与TGF-β抑制剂联合使用后恢复T细胞活性,显著增加IFN-γ水平,并增强MC38荷瘤小鼠抗肿瘤能力[38]。

临床研究方面,包括TIM-3在内的多种新兴免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)已进入临床研究阶段[39]。通过在ClinicalTrials.gov检索得知,当前TIM-3已有19个临床研究项目,进展较快的研究已进入Ⅲ期阶段(NCT04266301),部分研究也即将进入或已经进入Ⅱ期阶段。TSR-022是由Tesaro研发的IgG4抗人TIM-3抗体,于2016年开始Ⅰ期研究(NCT02817633),该研究旨在确定TSR-022单一疗法的安全性以及联合PD-1抑制剂TSR-042的抗肿瘤活性[40]。由Symphogen生产的TIM-3单抗Sym023联合PD-1单抗Sym021的Ⅰ期研究(NCT03311412)于2017年开始,该研究评估Sym023的安全性、耐受性和剂量限制毒性[41]。礼来制药研发的TIM-3单克隆抗体LY3321367不论是单药治疗还是联合LY300054(抗PD-L1)都表现出较好的安全性和耐受性。在Ⅰ期研究(NCT03099109)中,免疫相关不良反应(immunerelated adverse events,irAEs)仅有2例,药代动力学/药效动力学模型显示,剂量≥600 mg时所有靶标均受到影响,NSCLC患者治疗结果显示,抗PD-1/PDL1难治性患者的客观应答率(objective response rate,ORR)和疾病控制率(disease control rate,DCR)分别为0%和35%,而在其他患者中ORR与DCR分别为7%和50%[42]。LY3415244为抗PD-L1/TIM-3双特异性抗体,在Ⅰ期研究(NCT03752177)中所有患者均出现抗药物抗体,且抗体水平较高,表明LY3415244具有较强的免疫原性[43]。具体临床研究详见表1。

表1 TIM-3抑制剂抗肿瘤临床实验信息概要Table 1 Summary of TIM-3 inhibitor anti-tumor clinical trial information

尽管联合阻断治疗有一定效果,但其毒副作用是不能忽视的指标。越来越多的报道展示了免疫检查点抑制剂带来了相当的毒副作用,联合阻断治疗比单药治疗显现出更强的irAEs,甚至不得不停药以缓解毒性[44]。皮肤毒性是最常见的首次应用ICI后的irAEs,在接受抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1治疗的患者中发生的比例分别为47%～68%和30%～40%,主要表现为瘙痒、水疱、皮疹,其他较严重的irAEs包括结肠炎、黄疸、免疫相关甲状腺炎、甲减/甲亢、免疫性肺炎等,部分irAEs须永久停止免疫治疗[45-46]。抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1单药治疗的irAEs发生率为15%～90%,严重irAEs约为0.5%～13%,尽管目前报道的TIM-3相关的irAEs较少,仅出现较低皮肤毒性,但不排除随着研究深入而出现3级及以上的严重irAEs[42,45]。因此,如何更有效地实现低毒性反应,是联合阻断治疗的一个待解决的问题。

4 结语

抗PD-1/PD-L1抗体因具有更好的临床疗效和耐受性,其临床应用已大大超越抗CTLA-4抗体。尽管如此,仍有大部分患者对ICIs治疗没有反应,还有部分患者经历了肿瘤消退、对ICIs产生耐药性以及肿瘤复发,只有少部分患者获得持久的疗效[47]。在对PD-1耐药患者的观察中发现,包括TIM-3在内的多种新兴替代性免疫检查点发生代偿性上调,当采用TIM-3与PD-1联合治疗方案后,抗PD-1治疗的反应性得到恢复[48-49]。此外,PD-1是记忆性CD8+T细胞发育和维持稳定的关键分子,T细胞PD-1的缺失会导致记忆性T细胞数量下降,表明PD-1阻断可能对再次免疫应答造成损伤[50]。TIM-3可作为免疫检查点治疗组合策略中的一个重要靶点,但仍有许多挑战,包括缺乏评估治疗效果的标志物、几种免疫检查点之间的相互代偿等。

TIM-3作用广泛,除参与炎症反应、移植排斥反应和自身免疫病外,也是肿瘤发生免疫逃逸的因素之一。根据目前TIM-3的相关研究,仍有许多方面存在争议,如相关配体的确立、具体的下游信号通路等,仍需继续深入研究。总体来说,研究TIM-3在肿瘤免疫中的作用机制,将有助于我们进一步对肿瘤治疗产生更多的可能性。目前,越来越多的TIM-3单抗进入临床研究阶段,我们期许着令人兴奋的结果。