李文举罗福龙王凤忠贯东艳范 蓓Alberto Carlos Pires Dias王 琼钟 武

(1.西南医科大学附属医院急诊医学部,四川 泸州 646000;2.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193;3.葡萄牙米尼奥大学生物系,分子和环境生物学中心,中葡药食植物资源研究中心,葡萄牙 布拉加 4710-057;4.西南医科大学附属中医医院中葡中医药国际合作中心,四川 泸州 646000;5.四川省康复医院,成都 611139)

脓毒症(sepsis)是ICU常见重症之一,因为其起病快,病死率高的特点,目前已经成为国际上讨论的主要健康问题[1]。在脓毒症的疾病发生发展过程中,免疫调节失衡所导致的过度炎症和免疫抑制状态是导致多器官损伤的主要原因。目前主要以抗菌及多种支持治疗方案管理脓毒症患者,但长期的侵入性检查、治疗易导致感染,包括抗生素的过度使用出现的耐药性等副作用都在影响着脓毒症的治疗。因此,中药结合抗生素方案逐渐成为脓毒症临床治疗探索的策略之一[2-3]。

最新药理学研究表明,金银花(Lonicerae japonicaeflos)是一种具有抗炎、抗菌、免疫调节、抗氧化及抗病毒及等功能的中草药[4]。其复方制剂如痰热清、热毒宁及金银花单体中部分成分被证明对脓毒症炎症抑制及免疫调节等有较好的辅助治疗效果[5-6]。但目前对金银花改善脓毒症免疫状态的机制研究较少,且由于金银花成分复杂,二者相关结合研究存在困难。因此,我们首先使用超高效液相色谱-高分辨质谱技术对金银花水提物进行成分分析。在此基础上,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞构建脓毒症细胞模型,进而通过体外实验研究金银花改善脓毒症的可能机制。

1 材料和方法

1.1 细胞

小鼠RAW264.7巨噬细胞购于北京大学医学部。

1.2 主要试剂及仪器

金银花产自山东,购自北京太洋树康药业有限责任公司(批号2008113),经水提、浓缩、喷雾干燥、粉碎而成;DMEM培养基(Thermo Scientific,批号11965092);胎牛血清(Gibco,批号:10099141);LPS(Sigma公司,批号12880);RNA提取试剂盒(艾德莱,批号RN28);cDNA反转录试剂盒(Promega, 批号A5000);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein,批号:E096-01B)。细胞培养箱(美国,Thermo);酶标仪(美国,MolecμLar Devices);CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad);低温高速离心机(德国 Eppendorf公司,型号:5430R)。UPLC-QExactiveOrbitrap-MS四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技公司);超高效液相色谱系统(赛默飞,Ultimate3000);色谱柱LO90AC18(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)。

1.3 实验方法

1.3.1 金银花水提物成分检测及活性靶点研究

(1)UPLC-QE-Orbitrap-MS分析金银花水提物成分

精密移取金银花提取物1 mg,用1 mL 70%甲醇溶解,超声处理15 min,离心(1000 r/min,10 min),取上清,过微孔滤膜(0.22 μm),进行超高效液质(UPLC-QE-Orbitrap-MS)分 析。色 谱 柱 为Waters UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm);

流动相A(甲酸水溶液:0.1%),B(甲酸乙腈溶液:0.1%);梯度洗脱条件为0～15 min:5% B→90% B;15 ～20 min:90% B,20 ～20.1:90% B→5% B,20.1～30 min:5% B;流速为0.3 mL/min;柱温:30℃;进样量为5 μL。该系统与QE Orbitrap质谱仪(美国Thermo Fisher Science)相连。电喷雾离子源,正、负离子切换全扫描(100～1500 Da扫描范围),离子源温度320℃,电离源电压3.8 kV(+),辅助气加热温度:350℃,分辨率70000,载气为高纯氮气,鞘气流速25 L/min,辅助气流速8 L/min,碰撞能量15、30、45 eV。使用Compound Discoverer(2.1.0.401版)导入数据,结合本地OTCML数据库进行成分预测。

(2)金银花水提物活性成分的对应靶点研究

通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP:Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform)、Swiss靶点预测平台(Swiss Target Prediction)及相关文献检索筛选金银花活性成分及靶点数据,通过Perl脚本对药物有效成分及对应靶点进行匹配。在uniprot(https://www.uniprot.org)依次选择“human”、“reviewed”下载最新所有已经验证的人类基因靶点信息数据包,通过Perl脚本匹配金银花活性成分及对应靶点Gene Symbol。

1.3.2 脓毒症疾病靶点研究

从GEO数据库下载GSE28750[7]、GSE54514[8]、GSE67652[9]、GSE69528[10]的脓毒症表达谱数据。GSE28750包括10例脓毒症和20名健康人群的全血样本。GSE54514基于基因芯片平台GPL6947(35例脓毒症,18例健康样本),GSE67652基于芯片平台GPL16699(12名脓毒症患者及12名健康志愿者),数据集GSE69528基于平台GPL10558(28名健康人和83名脓毒症患者)。根据平台中的注释信息,使用探针ID来识别相应的基因。使用R软件的Limma软件包(版本:3.40.2)研究mRNA的差异表达,校正数据批次。在GEO中分析了调整后的P值以纠正假阳性结果。以“AdjustedP＜0.05且log2(倍数变化)＞1或log2(倍数变化)＜-1”为阈值筛选差异表达基因。同时,以关键词“sepsis”、“septic”、“septic shock” 在Genecard(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)数据库搜索脓毒症疾病靶点,使用Uniprot数据库(https ://www.uniprot.org/)对疾病疾病靶点进行靶点基因识别转换,与GEO分析所得差异基因进行整合,消除重复项,最终得到脓毒症靶点基因数据库。

1.3.3 金银花水提物活性成分与脓毒症靶点相关性研究

基于1.3.1、1.3.2所整理的数据,使用R包根据金银花活性成分靶点与金银花水提物-脓毒症复合靶点预测出金银花治疗脓毒症活性成分,通过Perl脚本和Cytoscape软件构建金银花活性成分-脓毒症靶点网络。

1.3.4 金银花水提物活性成分与脓毒症靶点蛋白质互作网络及核心基因研究

在上述分析结果的基础上,我们将金银花活性成分对应靶点与脓毒症靶点基因数据库进行匹配,得到金银花-脓毒症复合靶点,上传至STRING(https://string-db.org/)在线平台进行蛋白质网络互作用(PPI)分析。本研究使用STRING数据库根据既往研究及大数据预测靶点基因来标注靶点基因与其他基因之间的功能交互作用,并通过网络图形予以展示。我们可以认为处于节点的基因在生物过程中发挥更重要的作用。并将蛋白质互作用网络图导入Cytoscape软件中,使用CytoNCA插件计算靶 点 基 因BC、CC、Degree、Eigenvector、LAC、Network,筛选出大于所有参数中位数的基因,生成核心基因网络[11]。

1.3.5 金银花治疗脓毒症的具有生物标志物特征的核心基因

为了对1.3.4中核心网络的基因赋予临床诊疗价值,本研究使用受试者操作特征曲线(ROC)对核心网络的基因进行分析。通过比较ROC曲线下面积(AUC)评估所选金银花靶点对脓毒症治疗特性,筛选其中AUC＞0.8的基因作为金银花水提物治疗脓毒症的潜在靶点基因。

1.3.6 金银花水提物对RAW264.7脓毒症细胞模型潜在靶点基因和炎症因子mRNA表达干预研究

小鼠巨噬细胞RAW264.7使用完全培养基(含10%胎牛血清DMEM高糖培养基)在细胞培养箱中孵育(5% CO2,37℃),选择细胞80%密度时进行实验。除对照组外,模型组和实验组均使用LPS(0.5 μg/mL)刺激RAW264.7细胞进行造模,其中实验组造模前使用浓度为75 μg/mL的金银花水提取物预处理2 h。造模24 h后按照说明书流程使用RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA、反转录和实时荧光定量,并计算各组分中金银花水提物治疗脓毒症相关炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS)和关键靶点基因的相对表达量。β-actin、IL-1β、IL-6、MAPK1和MYC等引物由擎科生物(中国,上海)设计、合成(表 1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.4 统计学方法

实验数据统计学分析及图片生成均采用GraphPad Prism 8.0软件进行,结果用平均数±标准差(±s)表示,组间比较采用Studentt检验,以P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金银花水提物的主要成分

UPLC-QE-Orbitrap-MS检测结果显示,在正、负离子流模式下共鉴定出59个可能的金银花水提物成分。经TCMSP、Swiss数据库及网络文献检索分析出金银花水提物活性成分23个,预测出对应靶点386个。金银花水提物总离子流图见图1,金银花水提物活性成分见表2。

表2 金银花水提物成分表Table 2 Constituents of Lonicerae japonicae flos water extract

图1 金银花水提物总离子流图Figure 1 Total ion current chromatogram of Lonicera japonica flos

2.2 金银花水提物治疗脓毒症的活性成分和靶点

联合分析GEO数据库中的四个基因芯片(GSE28750、GSE54514、GSE67652、GSE69528)发现了1298个与脓毒症相关的差异表达基因(图2A)。此外,整合了Genecard、OMIM、TDD、Drugbank 4大数据库的疾病靶标2533个(图2B),将疾病靶标与GEO分析结果相结合并消除重复值,进而确定了3831个脓毒症相关靶点。将金银花的活性成分靶标与脓毒症的疾病靶标进行匹配,筛选出244个金银花和脓毒症的复合靶标(图2C)。使用Cytoscape软件生成金银花水提物治疗脓毒症靶点-成分网络图(图3),按照Degree度值对化合物进行排名,木犀草素、山奈酚、槲皮素、马钱子苷和咖啡酸为排名前五的金银花水提物治疗脓毒症成分。

图2 金银花活性成分靶点与脓毒症靶点韦恩图Figure 2 Venn diagram of Lonicerae japonicae flos active ingredient target genes and sepsis target genes

图3 金银花活性成分-脓毒症靶点网络图Figure 3 Lonicerae japonicae flos active ingredient-sepsis target network

2.3 金银花水提物治疗脓毒症的核心靶点网络

将244个共同靶点上传至STRING,生成蛋白质互作用网络图,置信度得分设置为0.4,共有244个节点,4902条边,平均节点度值40.2(图4A)。将上述PPI网络导入cytoscape后使用CytoNCA插件对PPI网络进行BC、CC、Degree、Eigenvector、LAC、Network计算分析,再使用Perl脚本筛选出所有条件都大于中位值的核心基因,循环计算2次(第二次循环Betweenness＞21.0496、Closeness＞0.5212、Degree＞9、Eigenvector＞0.1078、LAC＞4.125、Network＞5.0142),最终预测出17个核心靶点基因(图4B、4C)(表3):MYC、ESR1、SRC、JUN、RB1、CCND1、MAPK8、TP53、NFKBIA、FOS、MAPK1、AKT1、HSP90AA1、PIK3R1、RELA、TNF、EGFR。

表3 金银花治疗脓毒症核心基因Table 3 Lonicerae japonicae flos sepsis hub genes

图4 金银花-脓毒症基因靶点PPI网络图和核心靶点网络图Figure 4 Lonicerae japonicae flos sepsis PPI network and hub genes network

2.4 金银花治疗脓毒症的具有生物标志物特征的核心基因

脓毒症诊断特性的ROC曲线结果显示核心靶点基因MAPK8、TP53、RELA、MAPK1和MYC的ROC曲线下面积(AUC)＞85(P＜0.05)。对脓毒症诊断特异性、敏感性均大于80,表现出了对脓毒症诊断较好的较好敏感性和特异性,进而选取作为金银花水提物治疗脓毒症的具有生物标志物特性的关键靶点基因进一步验证分析。见图5。

图5 金银花治疗脓毒症核心基因ROC曲线Figure 5 Lonicerae japonicae flos sepsis hub genes ROC curve

2.5 金银花水提物对脓毒症相关靶点和炎症因子的调控作用

用RT-qPCR测量脓毒症8个关键靶点基因(MAPK8、JUN、RELA、AKT1、MAPK1、TP53、MYC、FOS)及相关炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-10、iNOS、TNF-α)的相对表达水平。结果显示,与正常组相比,LPS 诱导的 RAW264.7细胞中脓毒症相关关键靶点基因和炎性因子表达显著上调(P＜0.05)。与模型组相比,金银花药物干预组MAPK8、TP53、RELA、MAPK1、MYC和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-10、iNOS、TNF-α表达显著降低,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见图6、图7。

图6 金银花对脓毒症关键靶点基因相对表达量的调控作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Lonicerae japonicae flos intervention group. Compared with the control group, *P＜0.05,****P＜0.0001.Figure 6 Effect of Lonicerae japonicae flos on relative expression of sepsis related hub genes

图7 金银花对脓毒症相关炎性基因相对表达量的调控作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Lonicerae japonicae flos intervention group. Compared with the control group, ****P＜0.0001.Figure 7 Effect of Lonicerae japonicae flos on relative expression of sepsis related inflammatory genes

3 讨论

本研究中,金银花水提物对细胞脓毒症模型炎症显示出显著的抑制作用。通过UPLC-QExactiveOrbitrap-MS检测得到金银花水提物主要成分,结合网络药理学对金银花进行成分分析及脓毒症治疗机制预测,发现金银花水提物的五种主要成分木犀草素、山奈酚、槲皮素、马钱子苷和咖啡酸参与抑制脓毒症炎症,进一步研究实验表明,MAPK8、TP53、RELA、MAPK1、MYC可能为金银花作用于脓毒症的关键药物靶点。

金银花水提物对脓毒症作用靶点的调控作用明显。导致脓毒症炎症反应失衡的相关靶点和通路很多,包括MAPK、NF-κB、IL-17、AMPK及mTOR等通路及靶点。其中,MAPK通路在致炎条件刺激下通过ERK、JNK、P38等途径在调控炎症因子生成方面发挥重要作用。本次研究发现MAPK通路中的MAPK8、MAPK1与下游通路RELA、TP53及MYC在金银花水提物改善脓毒症炎症过程中起了关键作用。MAPK8、MAPK1与RELA、TP53及MYC在先前的文献研究被提及通过MAPK/NF-κB、MAPK/P53、MAPK/c-MYC通路[12-14]在免疫介导多种炎症疾病中发挥作用。其中,TP53为肿瘤抑制基因,败血症期间T淋巴细胞中的P53表达可能有助于增强T细胞的凋亡,导致免疫功能障碍[15],TP53通过负向调节 mTOR通路,在真菌脓毒症期间通过自噬-凋亡途径对促进CD4T细胞细胞自噬发挥重要的作用[16-17]。MAPK1和MAPK8是MAPK通路中的主要亚族,当炎症反应发生时,中MAPK1通过NOD样通路将外部信号由细胞膜传递到细胞核,促进由NF-κB信号通路介导的各种炎症因子(如:TNF-α和IL-1β)的释放,加重细胞损伤[18]。另有针对MAPK3/MAPK1信号通路的靶向药物在治疗如小鼠海马体炎症[19]、系统性红斑狼疮[20]及急性肺部炎症[21]等各种炎症性疾病中具有重要的价值[21]。最新研究表明,在莲花清瘟治疗小鼠脓毒症急性肺损伤实验中,通过网络药理学分析及实验验证,同样筛选出TP53、MAPK1、MAPK8为脓毒症治疗关键靶点基因,并可能通过抑制 P53 介导的内在细胞凋亡途径减轻 LPS诱导的急性肺损伤[22]。另一关键靶点基因RELA在机体免疫过程中可被IL-1β以及TNF-α等细胞因子激活,进而活化NF-κB发挥促炎作用[23]。还可通过MAPK/c-Myc 通路调节巨噬细胞极化来减轻败血症诱导的急性肺损伤[24]。上述文献研究表明,我们的实验结果符合这5个靶点基因在脓毒症炎症相关信号通路中所涉及的基因的表达情况,金银花水提物在LPS脓毒症细胞模型中抑制了TP53、MAPK8、MAPK1、RELA表达,上调MYC基因表达。这表明金银花水提物中的多种活性成分可能通过作用于上述靶点及所在通路,调控过度炎症反应和免疫抑制来改善脓毒症的免疫失调,以及改善随后导致的多器官功能障碍和并发症。

长期大量的临床观察研究表明,脓毒症患者免疫功能受损所导致的炎症反应失调是脓毒症患者病情进展的重要原因[25-26],而金银花所含的主要成分在预防和改善脓毒症方面的作用已有初步探索。本研究使用RT-qPCR对脓毒症细胞模型的炎症实验结果表明,LPS造模后,IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等炎性因子及其诱导基因iNOS均高表达。与针对单一靶点的西药不同,中药可以通过多成分作用于多靶点来进行整体施治。当代中医认为脓毒症发生发展主因“毒”、“瘀”、“虚”。邪气侵袭,正邪交争,生痰生瘀,继而脉络瘀滞,致使脏腑不得气血濡养,机能紊乱,甚者内闭外脱。同时邪气流连亦可令正气渐伤,日久邪实正虚,正气将绝[2,27]。目前中医治疗脓毒症首选清热解毒疗法,其中单味中药金银花及提取物在目前研究中表现出良好的免疫调节功效[28]。金银花是我国传统清热解毒中药之一,药理学分析表明金银花的主要成分为黄酮、有机酸、挥发油及其他类物质,具有显著的清热解毒、抗炎、抗菌及抗氧化等功效。近年来的研究显示出金银花水提取物的某些成分在预防和改善脓毒症方面有较好的效果,特别是其中的黄酮及有机酸类化合物,如绿原酸[29]、金丝桃苷[30]、槲皮素[31]、异槲皮苷[32]及木犀草苷[6]等成分在既往研究中均被证明可预防脓毒症及其并发症,并且能减少脓毒症过程中炎症因子产生。既有研究表明,木犀草素可以改善脓毒症小鼠的急性肺损伤[33];在LPS诱导的巨噬细胞和小鼠模型中,抑制高迁移率族蛋白B1,降低炎症因子释放和脓毒症小鼠死亡率[34]。山奈酚可减轻小鼠脓毒症盲肠结扎穿刺模型的急性肺损伤[35],和白杨素协同作用时能提高败血症小鼠的存活率[36]。槲皮素能通过减轻炎症和氧化应激、降低TOL样受体的基因表达,调节免疫状态,改善脓毒症器官损伤[37]。马钱子苷通过调节巨噬细胞极化和抑制 NLRP3 炎症小体激活减轻脓毒症诱导的急性肺损伤[38]。咖啡酸衍生物绿原酸及咖啡酸苯乙酯可降低脓毒症大鼠的炎症和氧化应激[39]。在本研究中,同样含有木犀草素、山奈酚、槲皮素、马钱子苷和咖啡酸五种主要成分的金银花水提物在LPS脓毒症模型中抑制了炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS基因mRNA的表达,进一步证实了上述早期发现。

近几年研究发现,脓毒症患者早期同时存在炎症反应过度激活和免疫抑制状态,二者相互作用,共同影响脓毒症的发生发展[40]。这也解释了为什么单纯地抗感染治疗并不能明显改善脓毒症患者预后。现在,我们可以利用超高效液相质谱技术分析中药有效成分和生物信息学大数据分析相关靶点,筛选出金银花改善脓毒症的基因并探索其机制,为金银花在脓毒症的临床治疗找到关键靶点,为后期药物研发提供理论依据和实验基础。

综上,我们对金银花治疗脓毒症的活性成分及药物-脓毒症核心靶点进行了研究,发现金银花治疗脓毒症具有多成分、多靶点的特点,并找出金银花治疗脓毒症可能的活性成分木犀草素、山奈酚、槲皮素、马钱子苷和咖啡酸,以及金银花防治脓毒症的机制与调控MAPK及下游通路靶点TP53、MAPK8、MAPK1、RELA、MYC和调控的炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS有关。此研究为金银花活性成分如何发挥治疗脓毒症的深入研究提供参考,也为相关疾病治疗提供新的思路。