张立魁杨灵波王学宁

(山西白求恩医院,太原 030032)

主动脉夹层(aortic dissection,AD)是指由于各种原因引起血管内皮的损伤,血液经损伤内膜进入中膜,导致主动脉壁层的分离并随后形成有或没有连通的真腔和假腔的一类疾病[1]。据统计急性主动脉夹层的发生率估计为2.6～3.5/100000,起病急骤,死亡率高,21%的患者在入院前死亡,68.2%在入院48 h内死亡,1周内病死率高达90%[2-3]。虽然我国目前尚未有AD的流行病学数据,从既往研究报告推断,AD发生率呈逐年上升趋势。除了由遗传突变引起的家族性疾病(马凡氏综合症和Loeys-Dietz综合症)外[4],AD发作之前的情况,或者AD发作之后的急性或慢性期,分子发病机理在很大程度上是未知的。关于AD相关的诊断和治疗干预方法的病理生理,正在研究中。

一项基于人类AD组织中3000多个基因cDNA微阵列数据显示,炎症反应,细胞外基质代谢,增殖反应和蛋白质合成的基因在AD发生发展中发生了变化[5]。另外更全面的生物信息学分析显示,AD疾病发生的信号调节网络中,Janus kinase-2(JAK2)处在核心位置[6]。动物实验揭示了巨噬细胞和成纤维细胞可通过白介素6(interleukin-6,IL-6)和单核细胞/巨噬细胞趋化因子MCP-1等促炎细胞因子产生炎症反应参与AD的发病机制[7]。在AD的不同阶段之间,巨噬细胞的浸润活性和位置是不同的。总的来说,巨噬细胞首先在主动脉外膜中积聚并浸润介质,在亚急性和早期组织阶段,巨噬细胞主要集中在外周脂肪组织中;在急性期巨噬细胞(CD68+)集中在血肿中,内膜和中层邻近血肿[8]。除此之外,巨噬细胞除驱动主动脉的病理性破裂之外,也参与AD中发生的组织修复过程[9]。因此,鉴定对AD的发病机理和修复有贡献的特定巨噬细胞群对于研究AD发生发展至关重要。

该研究通过分析AD相关的转录组数据,探索AD相关的细胞群体变化,同时分析AD相关差异基因所执行的生物学功能和信号通路。在此基础上,我们利用Ang II和BAPN构建的AD小鼠模型,探索巨噬细胞分型在AD发生中的具体变化,为研究巨噬细胞在AD扮演的角色提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级雄性C57BL/6小鼠40只购自山西医科大学实验动物中心[SCXK(晋)2019-0004],动物饲养于山西医科大学实验动物中心[SYXK(晋)2019-0007],体重(19.5±0.42)g,鼠龄6～8周。实验动物使用、操作许可由山西白求恩医院(山西医学科学院)实验动物伦理委员会批准通过(SBQDL-2021-002),动物护理和本研究的所有实验都遵循国家实验室动物中心和山西白求恩医院(山西医学科学院)实验动物中心的指导方针,并按实验动物使用的3R原则,尽量动物替代、减少动物用量、降低动物痛苦伤害,给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

苏木素(G1120,索莱宝 中国);伊红(G1120,索莱宝 中国);OCT冰冻切片包埋剂胶(4583,索莱宝中国);0.1% Triton X-100(T8200,索莱宝 中国);5%山羊血清(SL038,索莱宝 中国);CD68(1∶250,abcam,ab216526),iNOS(1∶250,abcam,ab178945),CD206(1∶250,abcam,ab64693);羊抗小鼠FITC(1∶500,SF132,索莱宝 中国);羊抗兔RBITC(1∶500,SR134,索莱宝 中国);DAPI(C0065,索莱宝 中国);RIPA裂解液(P0013B,碧云天 中国);BCA试剂盒(23225,赛默飞 美国);TGX Stain-FreeTM预制胶(5678081,伯乐 美国);CD68(1∶1000,ab216526 abcam England);iNOS(1∶1000,ab178945 abcam England);CD206(1∶1000,ab64693 abcam England);羊抗小鼠(1∶10000,SE132,索莱宝 中国);羊抗兔HRP(1∶10000,SE134,索莱宝 中国);增强的化学发光检测试剂盒(PE0010,索莱宝 中国);IL-6(E-EL-M2453c,伊莱瑞特 中国);IL-10(EEL-M0046c,伊莱瑞特 中国)。显微成像系统(Scope A1,蔡司 德国);凝胶成像仪成像(ChemiDoc XRS+,Bio-Rad 美国);酶标仪(Elx808,伯腾 美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 AD相关的转录组数据

本研究从NCBI公共基因组学数据库Gene Expression Omnibus(GEO)下载AD相关的mRNA转录组数据集,检索词为:aortic Dissection,expression profiling by array, homo sapiens,截止时间为2021.04.15。

1.3.2 差异基因分析及相关生物学功能和信号通路注释

研究使用R 4.0.2 edgeR包,利用经验贝叶斯方法用于对mRNA转录组数据集进行归一化处理,当log|FC|≥1和P＜0.05,认为基因为AD相关差异基因。之后,采用R 4.0.2 clusterProfiler包,对差异基因进行生物学功能注释(gene ontology,GO)和信号通路注释(kyoto encyclopedia of genes,KEGG)。

1.3.3 AD血管内环境细胞分析

CIBERSORT是一种分析工具,具有547个标记基因的基因表达矩阵,基于反卷积算法,可以用于量化mRNA转录组数据集的免疫细胞组成部分[10]。研究从CIBERSORT网站(http://cibersort.stanford.edu/)下载带注释的基因矩阵LM22,可定义22种免疫细胞亚型,包括7种T细胞、幼稚B细胞、记忆B细胞、浆细胞、静息NK细胞、活化的NK细胞、单核细胞、M0、M1、M2巨噬细胞、静息的树突状细胞、活化的树突状细胞、静息的肥大细胞、活化的肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞。使用R.4.0.2 CIBERSORT包分析来自TCGA和GEO队列的AD血管内环境的免疫细胞组分。

1.3.4 AD动物模型造模

清洁级雄性C57BL/6小鼠40只。将小鼠随机分为BAPN腹腔注射组,Ang II腹腔注射组,BAPN和Ang II联合注射组,生理盐水腹腔注射组,每组10只。BAPN注射剂量:100 mg/(kg·d),Ang II注射剂量:4 mg/(kg·d),BAPN和Ang II联合剂量为100 mg/(kg·d)和4 mg/(kg·d)。每日按实验方法对不同组别小鼠给予药物处理,给药2周,每8 h观察1次小鼠,每2 d记录1次体重,直至实验结束。待实验结束后,使用戊巴比妥钠静脉麻醉小鼠后,取静脉血,离心后,冻存至-80℃冰箱。随后颈椎脱臼法处死小鼠,体视显微镜下分离主动脉,从主动脉根部剥离动脉至髂动脉分支处,小心去除动脉外膜的疏松结缔组织,观察夹层形成情况,随后一部分用4%甲醛固定,另一部分冻存至-80℃冰箱。

1.3.5 苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)

4%多聚甲醛灌注固定主动脉组织,石蜡包埋。切成5 μm厚度的切片。切片烤片后,脱蜡、水化,苏木素染色5 min,盐酸酒精分化数秒,氨水浸泡15 min,伊红染色2 min,蒸馏水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。

1.3.6 免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)

用OCT冰冻切片包埋剂胶固定出主动脉,由病理科专业人员用冰冻切片机切6 μm厚度冰冻切片。冰冻切片组织丙酮固定10 min,PBS洗3次,0.1% Triton X-100通透10 min,5%山羊血清封闭30 min,去除封闭血清,CD68(1∶250),iNOS(1∶250),CD206(1∶250)一抗4℃孵育过夜,羊抗小鼠FITC(1∶500)和羊抗兔RBITC(1∶500)二抗室温孵育30 min,DAPI室温染核5 min,用抗荧光淬灭封片剂封片,于显微成像系统观察。

1.3.7 免疫蛋白印迹(Western blot)

使用RIPA裂解液提取主动脉蛋白,BCA试剂盒测定样品的蛋白浓度。TGX Stain-FreeTM预制胶恒压250 V,电泳25 min,待染料前沿移行到距离凝胶底部2～3 mm时停止,利用湿转法,恒流200 mA将蛋白转移至PVDF膜上(时间可根据目的蛋白分子量适当调整)。5%脱脂牛奶室温封闭2 h,CD68(1∶1000),iNOS(1∶1000),CD206(1∶1000)4℃摇床过夜,PBST洗膜3次,每次10 min,之后使用羊抗小鼠(1∶10000)和羊抗兔HRP(1∶10000)二抗室温孵育30 min,PBST洗膜3次,每次10 min。利用增强的化学发光检测试剂盒检测蛋白质信号。使用凝胶成像仪成像并进行半定量分析。

1.3.8 酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)

主动脉组织用冷PBS(0.01 mol/L;pH = 7.2～7.4)洗涤去除血液。将干净的组织切成小块,并在冰上的PBS中匀浆。收集组织匀浆并在4℃下以3000 r/min离心5 min。根据制造商的说明,使用ELISA试剂盒对上清液进行了IL-6和IL-10的检测。使用酶标仪于450 nm 波长处检测OD值。建立标准曲线,定量计算主动脉组织中IL-6和IL-10的含量。

1.4 统计学方法

使用R4.0.2软件进行统计分析。经验贝叶斯方法用于对mRNA转录组数据集进行归一化处理,当log|FC|≥1和P＜0.05,认为基因为AD相关差异基因。计量资料数据采用平均数±标准差(±s)表示。方差齐时,两两比较采用LSD-t检验;方差不齐时,两两比较采用Mann-Whitney U检验;计数资料采用频数或构成比(%)表示,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD相关差异基因及相关GO分析和KEGG分析

研究根据材料和方法中描述的检索词,纳入AD相关mRNA转录组数据集为GSE147026,4例正常主动脉组织,4例AD组织。以log|FC|≥1和P＜0.05为条件,筛选出上调基因(AD组高于正常组)515个,下调基因(AD组低于正常组)415个(图1A)。GO分析和KEGG分析,以P＜0.05为筛选条件。其中GO分析包括细胞组分(cellular component,CC)、分子 功 能(molecular function,MF)、生 物 过 程(biological process,BP)。930个差异基因细胞组分主要集中在白细胞与细胞的粘附、细胞外结构组织、巨噬细胞激活、细胞外基质组织、白细胞迁移;分子功能主要集中在膜微区、膜筏、粘着斑、细胞-底物结、胶原蛋白细胞外基质;生物学过程主要集中在整联蛋白结合、Toll样受体结合、清道夫受体活性、受体活性、细胞外基质结构成分等(图1B)。930个差异基因KEGG分析主要集中在IgA的肠道免疫网络、FcγR介导的吞噬作用、类风湿关节炎、TNF信号通路、血管平滑肌收缩、细胞粘附分子、cGMPPKG信号通路、脂质和动脉粥样硬化、趋化因子信号通路等(图1C)。

图1 GSE147026差异基因筛选和相关生物学功能及信号通路分析Note. A, Screening of differentially expressed genes in AD and normal control tissues. B, GO enrichment analysis of differentially expressed genes. C, KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes.Figure 1 GSE147026 differentially expressed genes screening, related biological function and signal pathway analysis

2.2 AD主动脉的免疫细胞构成

研究根据材料和方法中描述的检索词,纳入AD相 关mRNA转 录 组 数 据 集:分 别 为GSE147026,4例正常主动脉组织,4例AD组织。经验贝叶斯法对转录组数据集进行矫正后,使用CIBERSORT对主动脉血管内细胞成分进行注释,并以条形图显示结果,其中不同颜色代表不同的细胞亚群(图2A)。此外,GSE147026中(图2B),幼稚B细胞(P=0.029)、M1巨噬细胞(P=0.044)在AD组织中表现出更高的浸润水平,活化NK细胞(P=0.055)在正常主动脉组织表现出更高的浸润水平,M0(P=0.186)和M2(P=0.178)在AD组织中表现出较高的浸润水平,但差异无统计学意义,其余细胞类型在正常主动脉和AD中没有显著差异。

图2 主动脉夹层血管壁中细胞类型分析Note. A, Composition of different immune cell subpopulations in each sample. B, Different infiltration level of immune cell in AD tissue and normal aortic tissue.Figure 2 Analysis of cell types in the vessel wall of aortic coarctation

2.3 AD小鼠模型主动脉病理形态学

对照组未发现肉眼可见的主动脉夹层形成,血管壁结构完整,平滑肌细胞排列整齐;各实验组主动脉可见明显扩张及壁内血肿;BAPN+Ang II组假腔中血细胞充盈,血管壁增厚,血管外膜中炎性细胞浸润较BAPN组和Ang II组明显,BAPN组次之,Ang II组最轻(图3)。

2.4 AD小鼠模型主动脉巨噬细胞分布

为了深入研究BAPN、Ang II以及BAPN联合Ang II诱导AD小鼠巨噬细胞极化情况。我们使用CD68和iNOS标记M1型巨噬细胞,CD68和CD206标记M2型巨噬细胞。小鼠主动脉免疫荧光显示,BAPN组M1型和M2型巨噬细胞浸润较Ang II浸润丰富,相对于BAPN+Ang II组较少(图4A、4B),BAPN+Ang II诱导AD小鼠 M1型和M2型巨噬细胞浸润最丰富(图4C),对照组M1型和M2型巨噬细胞浸润最少(图4D)。

图4 β-氨基丙腈联合血管紧张素Ⅱ、β-氨基丙腈、血管紧张素Ⅱ 主动脉夹层小鼠模型血管壁中M1、M2型巨噬细胞分布Note. A, Immunofluorescent staining of CD68 in normal control aorta tissues or AD tissues induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II. B,Immunofluorescent staining of CD206 in normal control aorta tissues or AD tissues induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II.Figure 4 Distribution of MI and M2 macrophage in AD tissue induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II

利用Western blot及ELISA进一步检测小鼠主动脉巨噬细胞表面marker及分泌蛋白,探究AD小鼠巨噬细胞极化情况(图5A～5E)。研究发现iNOS(P=0.0007)、CD206(P=0.0020)、IL-6(P=0.0006)和IL-10(P=0.0001)蛋白表达在BAPN+Ang II诱导组表达相较对照组而言最高;iNOS(P=0.0006)、CD206(P=0.0265)、IL-6(P=0.0023)和IL-10(P=0.0002)蛋白表达在BAPN诱导组表达相较对照组而言高表达,但较BAPN+Ang II诱导组表达较低;iNOS(P=0.0044)、CD206(P=0.0713)、IL-6(P=0.0639)和IL-10(P=0.0027)蛋白表达在Ang II诱导组表达相较对照组而言高表达,但较BAPN+Ang II和BAPN诱导组表达均低。

注:红色箭头:主动脉夹层病变部分。

图5 β-氨基丙腈联合血管紧张素Ⅱ、β-氨基丙腈、血管紧张素Ⅱ主动脉夹层小鼠模型血管壁中M1、M2型巨噬细胞相关分子标志物及分泌细胞因子分析Note. A～C, Immunoblot analysis of the protein expression of iNOS and CD206 in AD and normal aorta tissues. D～E, ELISA of cytokines in AD aorta tissues or normal aorta tissues homogenates. Compared with the corresponding group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 Expression of M1 and M2 macrophage marker in normal aorta tissues or AD tissues induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II

3 讨论

Ang Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应肽,短时间内可引起血管收缩,提高血压,增加血流对血管壁的冲击[11];诱导平滑肌细胞(VSMC)过度肥大、细胞外基质(ECM)过度分泌,导致炎性细胞浸润,破坏血管,诱导主动脉夹层的形成[12]。据Gavazzi以Tieu等[7]的报道,选用7～30Ⅱ周龄的雄性C57BL/6小鼠,微量缓释泵灌注AngⅡ,其AD发生率分别为23%和25%。β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)通过抑制胶原纤维的交联来诱导主动脉夹层[13],Van等[14]使用含0.25% β-氨基丙腈的饲料饲养小鼠,建立了小鼠AD模型,报道AD发生率为64.7%。本研究采用BAPN联合Ang Ⅱ腹腔注射较文献报道饲料喂养、给水灌胃在剂量方面更易控制;较微量泵而言,虽然不能模拟持续给药过程,但每隔8 h给药一次,操作更简单,造模费用更低,无须特殊仪器。之后通过分析人AD组织转录组芯片以及体内采用单独Ang II、BAPN以及Ang II和BAPN联合干预C57BL/6小鼠,探究不同干预情况下巨噬细胞在AD中的表型变化。

本研究通过分析AD相关转录组芯片,分析发现差异表达基因中炎症相关疾病的表达在AD组中显著升高;GO分析发现白细胞与细胞的粘附、巨噬细胞激活、细胞外基质组织、白细胞迁移等介导炎症相关细胞功能的差异基因富集均显著升高,同时KEGG分析也提示差异基因中炎症相关信号通路的富集也显著增加,这些结果证明在AD发生中炎症活化显著增强,提示炎症在AD发生中扮演着重要的角色。本研究进一步分析在AD发生中免疫细胞浸润数量是否发生改变,通过探究发现包括单核/巨噬细胞等多种免疫细胞在AD发生中浸润增加,其中M1型巨噬细胞在AD组织中的增加最为显著,这进一步确证了巨噬细胞等免疫细胞在AD的发生发展中的重要作用。

随后我们通过体内实验进一步验证前期的分析结果。BAPN是赖氨酰氧化酶抑制剂,可诱导主动脉壁囊性内侧变性[15],Ang II通过AT1受体,将巨噬细胞招募至主动脉[16],分化为M1和M2型巨噬细胞,形成炎症微环境[17],促进AD的发生发展。我们利用Ang II及BAPN构建AD小鼠模型,发现AD小鼠模型中M1和M2型巨噬细胞均增高,BAPN+Ang II组最高,BAPN次之,Ang II最少。这些结果证明在AD发生发展中巨噬细胞的浸润显著增加,进一步提示巨噬细胞在AD的病理进程中的重要介导作用。

Jain等[18]研究证实,Ang II通过激活 JAK2/STAT5诱导血管平滑细胞的RANKL表达,而巨噬细胞通过RANKL对动脉瘤疾病的发展至关重要。Sun等[19]研究表明,炎症可能是主动脉瘤发病的常见机制,特别是,在主动脉瘤患者的胸主动脉样本中普遍观察到巨噬细胞的浸润,但关于巨噬细胞在AD中的表型变化相关研究较少。血管修复与心血管疾病(CVD)、动脉瘤、川崎病(KD)、主动脉夹层(AD)、深静脉血栓形成(DVT)等其他血管生成性疾病多种生理和病理过程相关[20]。血管新生在血管修复中往往涉及细胞增殖,迁移,分化,管形成和血管生成因子调控等过程。近年来研究发现巨噬细胞可根据局部微环境信号分化为组织特异性巨噬细胞,包括M1(经典激活)或M2(交替激活)两个亚型。M1型巨噬细胞由脂多糖(LPS)或干扰素(IFN)-γ激活,在组织中发挥促炎作用,加剧组织损伤,其特异性标记物包括诱导型NO合成酶(iNOS)、白细胞介素-12(IL-12)[21]。M2型巨噬细胞由IL-4、IL-13、免疫复合物、糖皮质激素、转化生长因子(TGF)-β介导极化激活。在创伤愈合和组织重建中,M2型巨噬细胞释放一系列抗炎产物发挥作用[22]。因此,我们的研究证实了不同表型巨噬细胞在AD组织中的浸润情况,M1/M2巨噬细胞共同作用,影响着AD的发展。我们提出假设,在AD的发生中,M1型巨噬细胞介导炎症的发生,促进AD的发展;M2型巨噬细胞的升高释放抑炎因子,促进组织的修复,这可能是机体在病理条件下的一种代偿性的保护机制。这也为后续的进一步机制探究及靶点干预提供潜在的研究思路。

在这项研究中,AD小鼠主动脉均有M1型和M2型巨噬细胞浸润,其中BAPN+Ang II组蓄积量最多。然而该项研究仍有一定的局限性,首先,基于动物的模型不能完全模拟人中AD的发病机理。其次,我们不能排除其他炎症细胞参与AD的诱导。综上所述,通过本研究,我们建立了基于BAPN+Ang II腹腔注射高效诱导小鼠AD模型,这为研究后续AD的治疗手段提供了有力的帮助。同时,通过对机制的探究,我们初步发现了AD的发生和发展与M1和M2型巨噬细胞浸润有着密切相关,这也为后续深入研究AD的发病机制及其干预手段提供了理论支持。