刘宁利，桑 洁

(1.西北大学附属西安市第三医院普外科，陕西 西安 710016；2.西安市第五医院普外科，陕西 西安 710082)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是来源于甲状腺滤泡上皮细胞的分化型甲状腺癌，是甲状腺恶性肿瘤中最常见的病理类型，占甲状腺恶性肿瘤总发生率的70%～90%，其恶性度较低，生长缓慢，患者预后良好，但仍有约10%的患者术后会出现复发、转移，预后较差[1-3]。近年来，基于分子靶标机制的探究为人类肿瘤的研究及攻克提供了方向及思路，已成为目前癌症研究的热点。因此，积极探寻更多与PTC发生发展相关的生物分子标志物对其临床诊治具有重要意义。叉头框蛋白Q1(forkhead box O1，FOXQ1)是FOX家族成员，其作为核转录调控因子能够调控细胞的增殖、分化、代谢及细胞周期等生物学过程，参与肿瘤的侵袭和迁移，与多种肿瘤的发生发展密切相关[4-6]。细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)是蛋白质激酶家族成员，其通过与细胞周期蛋白的结合来发挥作用，是调控细胞周期的关键酶，其过表达或抑制因子缺失可引起细胞周期紊乱、细胞增殖失控，是恶性肿瘤的重要特征之一[7-9]。研究证实，FOXQ1与CDK4在人类多种恶性肿瘤中异常表达，与临床病理参数及患者预后密切相关[6,9]，因此，本研究通过检测FOXQ1与CDK4在PTC组织中的表达，进一步探讨FOXQ1和CDK4表达与患者临床病理特征及预后的关系，以期为PTC的临床诊治及患者预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

回顾性选择2017年5月至2021年1月在西北大学附属西安市第三医院普外科行手术切除的110例PTC患者，收集PTC组织及癌旁组织(距PTC组织边缘1.5～2.0 cm)，患者均有明确的病理学诊断结果，术前未接受相关放化疗及新辅助治疗，无恶性肿瘤病史，未合并其他恶性肿瘤，病历资料及随访资料完整。收集入组患者的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤TNM分期、淋巴结转移情况及包膜侵犯情况等。本研究获得西北大学附属西安市第三医院医学伦理委员会批准(审批号2017-036)。

1.2 主要试剂

兔抗人CDK4和鼠抗人FOXQ1单克隆抗体购自英国Abcam公司；BCA试剂盒、蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂均购自上海碧云天生物技术公司；免疫组化试剂盒、DAB显色剂、抗原修复液及磷酸盐缓冲液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组化染色法检测FOXQ1和CDK4蛋白表达

取新鲜PTC组织进行研磨、匀浆处理，10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，以3 μm厚度连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢溶液孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶活性；pH 6.0枸橼酸缓冲液高压锅抗原修复，室温冷却，加入1 mol/L 缓冲盐溶液清除抗原修复液，5%山羊血清室温封闭30 min；滴加一抗FOXQ1单克隆抗体(稀释比例为1∶150)、CDK4单克隆抗体(稀释比例为1∶200)覆盖组织，37 ℃孵育过夜；次日滴加山羊抗IgG二抗(稀释比例为1∶2 000)，室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗涤3次；每张切片滴加DAB溶液200 μL行DAB显色，苏木素复染3 min，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，中性树脂封片，镜下观察拍照。

1.4 结果判读

每张切片随机取6个400倍镜下视野，结果取平均值。通过阳性染色细胞百分比与染色强度值进行计分，阳性染色细胞百分比：≤5%，6%～25%，26%～50%，51%～75%，>75%，依次记为0～4分；染色强度：无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色，依次记为0～3分。两项计分相乘所得总分为免疫组化评分，>3分记为阳性，≤3分记为阴性。

1.5 随访

采用门诊复查或电话等方式进行随访，观察并统计患者术后复发、生存情况，以随访截止时间2021年5月或死亡作为观察终点。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，FOXQ1和CDK4蛋白表达与临床病理特征的相关性采用χ2检验；K-M生存曲线分析患者术后生存率，采用Log-rank检验；Spearman秩相关检验分析PTC组织中FOXQ1和CDK4蛋白表达的相关性；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织中FOXQ1和CDK4蛋白表达

免疫组化染色结果显示，FOXQ1和CDK4蛋白表达阳性染色主要定位在细胞核或细胞浆，见图1。PTC组织中FOXQ1蛋白的阳性表达率为64.5%(71/110)，高于癌旁组织中FOXQ1蛋白的阳性表达率33.6%(37/110)，差异有统计学意义(χ2=21.025，P=0.000)；PTC组织中CDK4蛋白的阳性表达率为54.5%(60/110)，高于癌旁组织中CDK4蛋白的阳性表达率7.3%(8/110)，差异有统计学意义(χ2=57.554，P=0.000)。

a：FOXQ1蛋白表达；b：CDK4蛋白表达

2.2 FOXQ1和CDK4蛋白表达与临床病理特征的关系

FOXQ1和CDK4蛋白在PTC组织中的表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移均有关(P<0.05)；而与患者年龄、性别、肿瘤直径及包膜侵犯情况等无关(P>0.05)，见表1。

表1 FOXQ1和CDK4蛋白表达与临床病理特征的关系(例)

2.3 FOXQ1和CDK4蛋白表达与PTC预后的关系

截止2021年5月，随访时间4～49个月，中位随访时间为31个月，其中3例(2.7%)失访。K-M生存曲线显示，FOXQ1阳性表达患者的无进展生存率为80.3%(57/71)，与FOXQ1阴性表达患者的无进展生存率89.7%(35/39)比较，差异无统计学意义(Log-rankχ2=1.702，P=0.192)；CDK4阳性表达患者的无进展生存率为78.3%(47/60)，与CDK4阴性表达患者的无进展生存率88.0%(44/50)比较，差异无统计学意义(Log-rankχ2=1.939，P=0.164)，见图2。

a：FOXQ1的表达与PTC患者预后的生存曲线；b：CDK4的表达与PTC患者预后的生存曲线

2.4 PTC组织中FOXQ1和CDK4蛋白表达的相关性

Spearman秩相关检验显示，FOXQ1和CDK4蛋白在PTC组织中的表达呈正相关(r=0.545，P=0.000)，见表2。

表2 相关性分析

3 讨论

PTC是最常见的内分泌癌，总体预后良好，但少数低分化、间变性或某些特殊组织类型的PTC患者预后较差，易复发、转移，易对放射性碘治疗产生抵抗性[10]。近年来有研究发现，FOX转录家族可参与胚胎发育、调控细胞信号转导及肿瘤的发生，通过与DNA结合能够激活或抑制目的基因转录，参与胚胎发育、细胞周期调控和新陈代谢，在成熟的组织器官及生物体发育中具有重要作用[11]。FOXQ1是FOX转录家族的一员，位于人类第6号染色体6p25.3[12]。FOXQ1与肿瘤的发生密切相关。崔晓海等[13]研究发现，胃癌组织中FOXQ1表达与肿瘤TNM分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移等密切相关，其高表达患者预后更差；刘湘鄂等[14]研究发现，FOXQ1在前列腺组织中阳性表达率较高，与疾病的发生发展及预后相关。Weng等[15]研究显示，敲低FOXQ1可抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移，可作为评估结直肠癌患者预后的分子标志物。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)可赋予肿瘤细胞转移和侵袭能力，有研究表明，FOXQ1可通过介导EMT从而促进肿瘤的转移[16]。沉默FOXQ1可通过调控TGF-β1信号通路逆转PTC细胞的EMT，从而抑制肿瘤细胞侵袭和迁移[17]。本研究结果显示，PTC组织中FOXQ1蛋白阳性表达率较高，尤其是肿瘤TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者及发生淋巴结转移的患者，提示FOXQ1高表达能够促进PTC的发生发展及肿瘤浸润转移，可能通过介导细胞EMT进而发挥作用；预后随访观察发现，FOXQ1阳性表达患者术后无进展生存率低于阴性表达患者，但组间差异未见明显统计学意义，这与张中超等[18]的研究报道中FOXQ1表达与PTC患者预后关系密切不一致，可能是因为部分患者随访时间较短，到随访截止仍未出现疾病进展，数据统计不完全，导致研究结果偏倚，故FOXQ1表达对PTC患者预后生存的影响还需继续探究。结合既往研究分析可知，FOXQ1是重要的肿瘤分子生物标志物，可将其作为预测PTC疾病进展及治疗的一个靶点。

CDK4蛋白属于细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)家族中的一员，其与细胞周期蛋白D1结合形成复合体，可介导驱动细胞周期由G1期向S期转化，促进细胞分化、增殖，诱导肿瘤的发生发展。研究证实，CDK4与肿瘤的发生发展关系密切，抑制其表达能够使细胞周期阻滞在G1期，诱导细胞调亡，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移[19]。且有研究发现，CDK4表达与肿瘤临床特征及患者预后显著相关，如王彩莹等[20]研究报道，直肠癌组织中CDK4蛋白高表达与组织类型、淋巴结转移有关。非小细胞肺癌中CDK4蛋白表达与临床分期和淋巴结转移显著相关，表明CDK4蛋白与非小细胞肺癌的转移、侵袭有关[21]。CDK4蛋白过表达是影响骨肉瘤患者预后的危险因素[22]，表明CDK4是一个重要的肿瘤基因。近年肿瘤分子靶标治疗的研究发现，靶向CDK4/6是治疗恶性肿瘤的关键靶点[23]。CDK4/6抑制剂palbociclib可能在甲状腺癌的治疗中起到重要作用[24]。CDK4/6抑制剂ribociclib可降低甲状腺癌中CDK4蛋白表达，诱导细胞周期停滞在间期，抑制甲状腺癌细胞增殖[25]，CDK4可能是PTC的研究靶标。而本研究发现PTC组织中CDK4蛋白显著阳性高表达亦与淋巴结转移和肿瘤TNM分期有关，与邱丽浈等[26]的研究报道一致，提示CDK4可能参与了PTC的浸润转移及恶性进展，也可将CDK4作为PTC发生及治疗的靶标；术后随访发现，CDK4阳性表达患者无进展生存率低于阴性表达患者，但组间亦无明显差异，故CDK4表达对PTC患者预后生存的影响仍需继续探究。

另外本研究还发现，FOXQ1和CDK4蛋白在PTC组织中的表达呈正相关，提示二者在PTC的发生发展中可能起到协同作用，推测FOXQ1可能通过正向调控CDK4表达来影响细胞周期的调节，进而参与PTC的发生发展，然其更具体的调控作用还需通过细胞分子学实验进一步验证。

综上所述，PTC组织中FOXQ1和CDK4蛋白呈正相关性阳性高表达，与PTC患者临床分期、淋巴结转移及预后密切相关，可能参与PTC的发生、发展及转移。