贺云黄敏健陈艺生*

(1.福建医科大学基础医学院,消化道恶性肿瘤教育部重点实验室,福建省肿瘤微生物学重点实验室,福州 350122;2.福建省立医院临床医学实验研究中心,福建医科大学,福州 350001)

肝是机体重要器官,承担正常生理功能,包括药物、毒物代谢解毒作用。同时,肝也是毒素蓄积靶器官,易于受到损伤。肝损伤是临床常见疾病,也是各类原因所致肝疾病的病理基础和共同表型[1]。肝损伤表现为肝细胞氧化应激反应、DNA损伤、细胞毒性反应、线粒体功能障碍和炎性反应等[2-3]。慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可损害肝,特别是合并外来药物或其他刺激作用下,损伤作用更为明显,严重可导致肝癌发生[4]。全世界约有2.57亿人慢性感染HBV[5],中国是HBV感染的高发区,每年有30万以上的人死于HBV相关疾病[6]。全球卫生战略部门(Global Health Sector Strategy,GHSS)呼吁到2030年消除病毒性肝炎这一公共卫生威胁[7],研究HBV相关肝损伤的发病机制开发有效药物刻不容缓,合适的研究载体/模型不可或缺。传统评价肝损伤的模型包括体内和体外模型,其中,体内模型包括大小鼠、兔子、犬类等;体外模型包括各种细胞株,如肝原代细胞、Huh 7细胞系、HepG2细胞系等。其中,肝原代细胞来源于体内,携带完整基因组,保持有体内细胞的特性,相较于细胞系,对外界刺激更为敏感,在功能性研究和机制研究中占有极大优势[8]。

肝原代细胞提取方法广义上分为两种:组织机械分散法;消化分离法。机械分散法采用剪刀剪碎,吸管吹打等物理方式将原代细胞分离出,相较之下,消化分离法更为温和,采用胰酶将细胞从组织中消化分离出,得到的细胞损伤小。二步灌注法在肝细胞分离提取中的应用极为广泛,本研究采用比胰酶更为温和、效率更高的IV型胶原酶,通过灌注,将HBV转基因小鼠的肝原代细胞从组织中分离出。分离得到的细胞经低速低温离心法纯化。该方法比传统方法效率更高、操作较为简便,得到的细胞纯度好,活率高[9]。

本文试图通过二步灌注法分离纯化得到HBV转基因小鼠肝原代细胞(简称肝细胞),并应用于过氧化氢(H2O2)诱导的肝损伤研究中,初步探究该方法分离的原代细胞的应用价值,为慢性HBV感染的肝细胞生物学研究、药物代谢的评价以及病毒性肝炎的防治研究提供有效研究载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

3只6周龄雄性HBV转基因SPF级C57BL/6小鼠,体重约为14 ~ 16 g,购于江苏集萃药康生物科技股份有限责任公司【SCXK(苏)2018-0008】。饲养于福建医科大学实验动物中心【SYXK(闽)2022-0003】,昼夜照明12 h交替,保持湿度、温度恒定。高压的纯净水,无菌营养颗粒料饲料自由采食。动物实验通过福建医科大学动物伦理委员会审查(FJMU IACUC 2021-0359)。

1.1.2 主要试剂与仪器

KRB缓冲液(索莱宝科技),IV型胶原酶(Sigma),异氟烷(阿拉丁),DMEM细胞培养液(Thermo),胎牛血清(FBS,PAN),青霉素和链霉素双抗生素溶液(Gibco),DNAZol(百泰克),TBE缓冲液(索莱宝科技),DNA marker(杭州博日生物),糖原Periodic Acid-Schiff染色液(PAS染色液,碧云天生物科技),H2O2(国药集团),ROS检测试剂盒(Thermo),线粒体JC-1试剂盒(Invitrogen),CCK-8(同仁生物),乳酸脱氢酶LDH检测试剂(瑞源生物),凋亡试剂盒(BD),SYBR Green qPCR试剂盒(TaKaRa)。

自动细胞计数仪(Countstar),PCR仪(伯乐),凝胶成像仪(伯乐),细胞培养箱(Thermo),流式细胞仪(BD),激光共聚焦显微镜(Leica),荧光定量PCR仪(安捷伦),多功能酶标仪(Bio-Tek),全自动生化分析仪(日立)。

1.2 方法

1.2.1 HBV小鼠肝原代细胞分离纯化和培养

使用1%浓度的异氟烷对小鼠进行麻醉,小鼠深度麻醉后,固定于操作台。乙醇消毒体表,使用无菌剪刀剪开腹部皮肤,露出腹腔。将肠整理好置于右侧,暴露出下腔静脉和肝沿静脉。取20 mL预热的无钙KRB缓冲液,由下腔静脉中下段进针,初始速度为2 mL/min,见肝鼓起,颜色变浅时,立即间断肝沿静脉,使血液流出,灌注速度改为4 mL/min。第一步灌注结束后,更换含0.5%(w/v)IV型胶原酶的含钙KRB缓冲液,同速进行第二步灌注。待肝表面呈现龟裂纹理,肝外形不再直立时,停止灌注。用无菌眼科剪去除肝连接的结缔组织,并转移至盛有DMEM的洁净培养皿中。用无菌眼科镊撕开肝被膜,释放肝细胞。使用70目滤网,过滤杂质。于4℃,1000 r/min条件下,离心1 min,重复3次去除杂质。重悬于含有10% FBS的DMEM培养液。使用自动细胞计数仪进行计数,记录活细胞率等情况。

细胞以合适的密度种植于鼠尾胶原包被的孔板中,添加含有10% FBS和50 UI/mL青霉素和链霉素双抗生素溶液的DMEM细胞培养液,孔板置于5% CO2,37℃培养箱中贴壁培养。

1.2.2 鉴定HBV小鼠肝原代细胞

(1)形态学鉴定:肝细胞培养12 h初步贴壁后,取出,于显微镜下观察细胞形态,并拍照。后续于提取后第1,3,7天再次取出观察,拍照。

(2)糖原PAS染色鉴定:细胞爬片培养48 h后,按照试剂盒说明书进行操作,首先滴加50 μL高碘酸氧化处理10 min,清洗后,滴加50 μL Schiff染色液处理10 min,清洗后,使用苏木素进行核复染10 min,清洗后,封片。于显微镜下观察,拍照。

(3)HBV小鼠肝细胞鉴定:用1 mL DNAZol将细胞裂解,12 000 r/min离心5 min,取上清。然后,通0.5 mL无水乙醇沉淀,再经过75%乙醇洗涤2次,用50 μL水溶解DNA。取1 μg DNA加入聚合酶链式反应(PCR)体系进行分析,以水作为阴性对照,体系为:

94℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 45 s,35个循环。最后,于

TBE缓冲液中进行琼脂糖电泳,凝胶成像仪观察、拍照。其中,HBV引物序列如下:前引物5’-TTTGTTC AGTGGTTCGTAGG-3’,后 引 物:5’-TGTAAGTTGG CGAGAAAGTG-3’,产物长度为423 bp。

1.2.3 HBV小鼠肝原代细胞活性和凋亡检测

本课题使用CCK-8试剂检测细胞增殖活力,即细胞活性。细胞培养12 h初步贴壁后,取出,使用CCK-8工作液避光处理1 h,用酶标仪检测波长为450 nm处的吸光度值(OD值),根据试剂盒提供的公式进行数据处理,计算细胞活性,并以该时间点细胞活性为第0天的细胞活性。然后,其他孔的细胞分别于1 ~ 7 d同法操作,记录细胞活性情况。

细胞分别于提取后第1,3天取出,胰酶消化下,使用PBS清洗3次,分别加入5 μL凋亡试剂盒中的Annixin V染料,于暗处染色25 min,然后加入5 μL PI染料继续染色5 min后,用PBS清洗3次,用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

1.2.4 HBV小鼠肝原代细胞损伤检测

肝损伤实验中,细胞提取、培养24 h后,完全贴壁状态,加入5 μmol/L H2O2进行处理,诱导肝细胞损伤。以未加H2O2的细胞作为对照,培养48 h,进行后续实验。

(1)活性氧(ROS)检测:细胞预处理后,用PBS清洗2次,加入2 mL含 有25 μmol/Lcarboxy-H2DCFDA探针的孵育液,置于培养箱中避光孵育25 min。然后,用1 mmol/L Hoechst染料复染5 min。PBS清洗3次,保持湿润状态,于激光共聚焦显微镜下观察,拍照。

(2)线粒体膜电位检测:采用线粒体JC-1试剂盒对线粒体膜电位进行检测,操作如下:首先,弃去培养液,用PBS清洗2次,加入10 μg/mL JC-1,于培养箱中处理20 min进行染色,PBS清洗后,使用激光共聚焦显微镜观察激发光为488 nm处的细胞图像,并拍照。

(3)实时定量荧光PCR(RT-qPCR)检测氧化应激相关因子转录水平的表达:细胞从孔板中裂解下来,提取RNA,逆转录成cDNA,使用SYBR Green qPCR试剂盒,于荧光定量PCR仪中反应,以GAPDH为内参,检测过氧化氢酶(CAT),超氧化物歧化酶(SOD2)和单胺氧化酶(MAOA)的表达。其中,引 物 序 列 如 下:GAPDH:前 引 物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’,后 引 物:5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;CAT:前引物:5’-GCCAATGGCAATTACCCGTC-3’,后 引 物:5’-GAGTGTCCGGGTAGGCAAAA-3’;SOD2:前 引 物:5’-AGAACCCAAAGGAGAGTTGCT-3’,后引物:5’-AGGCAGCAATCTGTAAGCGA-3’;MAOA:前引物:5’-ATCTCAGGATTGGCTGCTG-3’,后 引 物:5’-TTCTGTTCTGGGTTGGTCC-3’。CAT,SOD2,MAOA产物长度分别为277、158、183 bp。然后,目的基因的相对表达量采用2-△△ct的方法进行数据处理,其中,△Ct(n)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);△△CT(n)=△Ct(n)-△Ct(1)。

(4)LDH泄露检测:留取细胞培养上清液,8000 r/min离心去除死细胞。细胞裂解后,12 000 r/min离心10 min,取裂解液上清和细胞培养液,采用LDH检测试剂,置于全自动生化仪中检测,根据试剂盒提供公式进行换算,计算LDH释放量。

1.3 统计学分析

每组实验重复3次,实验结果数据表达形式为平均值 ± 标准差(±s)。采用t检验分析统计实验组与对照组之间的差异,GraphPad Prism 7.0统计作图,P＜ 0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 HBV小鼠肝原代细胞分离纯化

通过二步灌注法分离纯化得到的肝细胞,经过全自动细胞技术仪计算,每只小鼠可分离得到(1.90 ± 0.12)×107个细胞,细胞活率可达82.56% ± 0.01%,细胞直径为(20.4 ± 0.07) μm,平均圆度0.63 ± 0.02。由此说明该方法能够快速、高效将HBV转基因小鼠的肝原代细胞分离出,且细胞完整,成活率高。

2.2 HBV小鼠肝原代细胞鉴定

形态学鉴定:如图1,肝细胞分离纯化12 h后(即第0天),初步贴壁,可观察到典型的肝原代细胞形态图,细胞呈圆形或类圆形,多数具有双核或者多核。细胞培养1 d后,观察到肝细胞已完全贴壁,出现伪足样突起,并开始聚集。3 d后肝细胞聚集成岛屿状,细胞形态发生变化,细胞膜进一步向外延伸形成伪足,呈现多边形结构,多数细胞多核化。第7天细胞形态:细胞形态发生改变,由圆形或多边形结构,变成长梭型,伪足数量减少或消失,胞体变薄,部分细胞的细胞核萎缩,呈现初步死亡状态,另外,培养皿中出现已经萎缩死亡或者已碎片化的细胞。通过这一系列形态学结构,我们可初步判定提取的细胞为肝原代细胞。

图1 HBV小鼠肝原代细胞形态观察Figure 1 Morphology of cultured primary HBV mouse hepatocytes

糖原PAS染色鉴定:提取的肝细胞需要进一步鉴定,采用PAS染色法,如图2,经过PAS染色与苏木素复染后,细胞核为蓝色(箭头),细胞质呈浅红色,大量深红色颗粒呈散在或者成片分布于细胞质中。由此确定,所提取的细胞为肝原代细胞。

图2 糖原染色结果Figure 2 PAS staining

HBV小鼠肝细胞鉴定:为了鉴定所提取细胞为HBV感染的肝原代细胞(见图3),本课题将所分离的肝细胞裂解,进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳,在400 bp上方位置可以观察到分离纯化的肝细胞具有阳性条带,此处阴性对照则无条带。

图3 HBV小鼠肝原代细胞鉴定结果Figure 3 Identification of cultured primary HBV mouse hepatocytes

2.3 HBV小鼠肝原代细胞活性和凋亡检测

首先,肝原代细胞种板贴壁,采用CCK-8法检测肝细胞活性,以第0天时检测所得细胞活性为基点,记为100%,依次检测连续7 d的细胞活性,从图4A中可以发现在刚开始的2 d内,肝细胞维持刚分离纯化时的活性,但从第3天开始,细胞活性成倍递增,在第5 ~ 6天时细胞活性最高,然后出现下降趋势。细胞凋亡验证时,本课题组选取细胞增长对数期的时间点(第3天),以第1天的细胞为对照,检测细胞自发性凋亡情况。流式细胞检测结果发现,第3天细胞凋亡率(11.25 % ± 4.78 %)和第1天的细胞凋亡率(10.25% ± 5.14 %)无差异(P＜ 0.05,图4B)。以上结果说明,肝细胞在第3天具有较高活性,且未发生自发性凋亡,适合应用于相关研究。

2.4 HBV小鼠肝原代细胞损伤检测

ROS检测实验中(图5A),观察到对照组细胞中,代表活性氧的绿色荧光定位于细胞质中,荧光强度较弱,而H2O2预处理的肝细胞中,胞质中绿色荧光强度明显增强,变亮(P＜ 0.05),说明细胞内活性氧积聚,发生氧化应激反应。

氧化应激过程往往伴随着相关因子变化,在氧化应激相关因子mRNA水平检测中,与对照组相比,H2O2预处理组的肝细胞中,氧化应激反应相关酶SOD2,CAT和MAOA的mRNA表达水平明显上升(P＜ 0.05,图5B)。

检测细胞内线粒体膜电位改变情况,由图5C可见,对照组细胞代表高电位聚合物的红色荧光很强,而代表低电位单体的绿色荧光强度较弱,线粒体处于高膜电位状态。相较之下,实验组的红色荧光减弱,绿色荧光增强,聚合物解离成单体,线粒体膜电位去极化,功能受到损害。

细胞发生损伤时,损伤标志物LDH从胞内释放致胞外,H2O2预处理的肝细胞裂解液和培养液上清分别使用全自动生化分析仪检测,通过计算,LDH释放情况如下图5D,以对照未处理组LDH泄漏率为1,H2O2组的LDH泄漏量明显增加,达到(4.35 ± 0.37)倍(P＜ 0.05)。

以上实验结果表明,H2O2造成HBV小鼠肝原代细胞内发生氧化应激,线粒体功能紊乱,产生细胞毒性。

注:A:第0 ~ 7天肝细胞活性检测;B:细胞凋亡检测,第3天细胞自发性凋亡细胞数。图4 HBV小鼠肝原代细胞活性和凋亡检测Note.A.Hepatocytes viability was detected within day 0 to day 7.B.Apoptosis of hepatocytes, on day 3.Figure 4 Cell vialbility and apoptosis of cultured primary HBV mouse hepatocytes

3 讨论

HBV持续感染是原发性肝癌的致病因素之一,在其发生发展过程中起重要作用[10],对经济发展和人类健康造成极大影响。多年来,为消除这一威胁,国内外研究者致力于HBV各方面的研究,在此过程中,合适有效的载体必不可少。体内研究模型适用于表型研究,具有准确、可靠的特性。探究机制则需用到体外模型,要求载体基因组稳定且可控,能够精准反映体内情况。为寻求优良体外研究载体,本课题使用二步灌注法分离纯化HBV转基因小鼠肝原代细胞,其操作简单,技术要求不高,对肝细胞损伤小,且易获得高量优质细胞。肝细胞分离纯化后,使用两种方法进行鉴定。首先,从形态学进行观察,新鲜分离的肝细胞边界清晰、大小均匀,具有典型性双核或多核结构。由于其形态随着培养时间增加发生改变,因而简单的形态学鉴定不够严谨,故本课题后续将在培养48 h后对肝细胞进行糖原染色。作为糖原的合成与储存场所,肝细胞可被PAS染成浅红至深红色。细胞质中存在成片的阳性染色,即可判断分离纯化得到的是具有糖原合成功能的肝细胞。为确定HBV小鼠肝原代细胞的应用最佳时间段,检测了第0 ~ 7天肝细胞的活性,细胞贴壁后第2~5天细胞迅速增殖,处于对数增长期,适合应用于肝细胞功能和机制研究。为多方位验证,选取细胞生长对数期的时间点(第3天)进行流式细胞术检测,活细胞数仍可达将近90%,且未发现自发性凋亡检测,确定第3天的肝细胞适用于肝细胞损伤研究。

注:使用H2O2处理肝细胞48 h后,检测细胞损伤情况;A:活性氧检测;B:氧化应激相关因子mRNA水平;C:线粒体膜电位检测;D:LDH泄漏检测;与未处理组相比较,**P ＜ 0.05。图5 H2O2致HBV小鼠肝原代细胞损伤Note.Injury effects were detected with H2O2 treatment for 48 h.A.ROS detection.B.mRNA levels of oxidative stress related factors.C.Mitochondrial membrane potential detection.D.Ratio of LDH leakage.Compared with untreated group, **P ＜ 0.05.Figure 5 Injury effects of cultured primary HBV mouse hepatocytes induced by H2O2

由于所处生理环境特殊,肝细胞极易受到外界因素影响。为研究分离纯化的肝细胞对药物或外界刺激的敏感度与反应强度,本课题通过使用低浓度H2O2作用于肝细胞,检测细胞内氧化应激反应及相关细胞生物学行为的影响,观察肝细胞的急性损伤。H2O2是一种强氧化剂,可通过胞内谷胱甘肽诱导肝原代细胞损伤[11]。氧化应激是评价肝损伤的重要指标,据报道,体内氧化与抗氧化之间的平衡被破坏可能造成肝损伤,严重可促进细胞发生凋亡[12-13]和其他报导一样[14],ROS探针检测发现肝细胞受到H2O2刺激后,发生氧化应激反应,表现为ROS生成增多,蓄积于细胞内。CAT是体内抗氧化酶之一,SOD2主要存在于线粒体内,是线粒体中重要的抗氧化酶,ROS的清除依赖于抗氧化酶的活化[15],因此,当机体发生氧化应激反应时,CAT和SOD2表达应激性增加。MAOA不仅是胞内活性氧的来源[16],同时介导线粒体ROS传递,提高活性氧浓度[17],所以,当H2O2诱发氧化应激时,MAOA表达水平上升。线粒体是细胞内产生ROS的主要场所,然而,这是一个可逆过程,当ROS过量蓄积时,线粒体功能受到损害[18-19]。同时,线粒体功能障碍可诱发细胞凋亡[20]。肝细胞受到H2O2影响时,线粒体膜电位由极化变成去极化状态,揭示线粒体功能异常。产生细胞毒性是肝细胞损伤的另一表现,LDH是一种广泛表达的酶,其释放已被用作膜损伤的标志物[21-22]。本课题通过LDH释放测量细胞毒性,高LDH泄漏率与H2O2造成的肝细胞损伤有关。综上,H2O2促HBV小鼠肝原代细胞发生氧化应激,产生细胞毒性,发生损伤。

相比于各种HBV细胞株,HBV转基因小鼠肝原代细胞来源简单,保留体内全套遗传信息,分离步骤简易,成本低,获得细胞数量大,符合医学伦理道德规范,能够为HBV发病机制研究和药物开发提供足够数量的、优质的研究载体。但由于肝原代细胞保持良好体内功能和细胞活性,需要新鲜分离,并于短时间内使用,是原代细胞作为研究载体的弊端。希望今后通过不断摸索和研究,保持原代细胞的较高增殖活性,延长其保存期限,保留良好体内功能,增强原代细胞的实用性,为克服HBV相关疾病提供裨益。